Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

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4 Analytik des intakten Peptidions (in Abb. 4.5 unten) verdeutlicht diese Tatsache. Sieht man von der Fragmentierung der Pbf-Schutzgruppe und der Aminofunktion am C- Terminus ab, ist das Mutterion (intaktes Peptid) im Wesentlichen nur an einer Stelle gebrochen, nämlich N-terminal zu Prolin. Die weitere Fragmentierung dieses Ions (MS(3)-Spektrum) ergab zwar Informationen über die Sequenz, jedoch handelt es sich dabei um Signale mit einer Intensität von 0,4-19% (Tabelle 4). Die Information wurde also mehr gesucht als gefunden. Hiermit sind wir an einer Schwachstelle der De-novo-Sequenzierung angelangt. Eine ideale Dissoziationsmethode sollte die Bindungen des Peptidrückgrats wahllos brechen, unabhängig von Peptidlänge, Ladung, m/z-Verhältnis, sterischer Anord- nung, Aminosäurenzusammensetzung und –abfolge. Eine solche Methode existiert jedoch nicht. [80] Während der stoßinduzierten Fragmentierung (CID) wird dem Mutterion in sehr kurzer Zeit (Pico- bis Mikrosekunden) Energie zugeführt, was zum Bruch der schwächsten Bindung im Molekül führt. Diese schwächste Bindung ist eine protonierte Amidbindung. Innerhalb eines Peptids besitzen Amidstickstoffe jedoch unterschiedliche pKb-Werte; somit unterscheiden sie sich in ihrer Labilität und verhalten sich nicht ideal. [81] Die N-terminale Seite von Prolin gilt als äußerst labile Stelle. Diese Beobachtung wird in der Literatur als Prolin-Effekt bezeichnet [82] . Hier führt nicht, wie früher angenommen, die Protonenaffinität von Prolin zur Fragmentierung, sondern die sterische Instabilität der Prolin-Bindung. [83-85] Es existiert eine Vielzahl von zum Teil kontrovers diskutierten massenspektrometrischer Fragementierungsmechanismen, einige davon wurden von Zhang [81] zusammen- getragen. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Probenkonzentration und -menge. Alle in der Arbeit durchgeführten De-novo-Sequenzierungsexperimente erfolgten nach einer Testabspaltung vom Harz. Hierzu wurde das Peptid von 0,5-10 mg Harz, was in etwa 400-8000 Harzkugeln entspricht, abgespalten und anschließend in 50-100 µl Lösungsmittel aufgenommen. Bei einem kombinatorischen Ansatz stünde jedoch nur eine einzige Harzkugel zur Verfügung. Zur erfolgreichen Durchführung der MS(n)- Experimente am für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Massenspektrometer (Esquire3000 plus ohne Nanoquelle) werden ca. 50 µl Probenlösung benötigt. Dies würde einer 3 µM-Lösung entsprechen, was unter der Nachweisgrenze des Geräts liegt. 54
4 Analytik Abb. 4.6 Summe aller MS(n)-Spektren. A, B und C zeigen jeweils ein und dasselbe Spektrum. Hervorgehoben sind die unterschiedlichen Fragmentionen-Reihen. Einfach- und zweifachgeladene Ionen der gleichen molekularen Masse sind durch gleiche Farbmarkierung gekennzeichnet. 55
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Neue Methoden zur Sequenzierung fes
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meinem Großvater Albert Anton Höf
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Vorwort Natürlich gibt es ein Lebe
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10.2 Massenspektren der fluoreszenz
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10.6 SPR-Experimente Steady state a
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