Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5 Anwendung der Methode
So wurde beispielsweise in der Röntgenstrukturanalyse von Strep-tag I eine
Salzbrücke zwischen GlyGly-OH (C-terminus Strep-tag) und Arg 84 (Streptavidin)
nachgewiesen. Der Einsatz von Glutaminsäure in zweiter Position Richtung
C-Terminus nach HPQ sollte diese Salzbrücke nachahmen können. [115] In beiden
Strep-tag-Sequenzen folgt C-terminal zum HPQ-Motiv ein Phenylalanin und N-
terminal zwei Positionen vor HPQ ein Tryptophan. Dies sollte auch in der Bibliothek
berücksichtigt werden. Außerdem wurde neben Phenylalanin auch noch
Thienylalanin eingesetzt, welches als unnatürliche Aminosäure Phenylalanin
ersetzen kann. [121] Es wurden sechs variable Positionen mit zweimal sieben, einmal
acht und zweimal fünf möglichen Aminosäuren erzeugt. Daraus ergibt sich eine
Mitgliederzahl von 9800 (=5x5x8x7x7) für diese Bibliothek.
Zum Aufbau der OBOC-Cyclopeptidbibliothek wurden 2 g aminofunktionalisiertes
TentaGel (130 µm/ ca. 1,5 Mio. Kugeln) mit Methionin versehen. Mit Standard-Fmoc-
Chemie wurde manuell die Massenspacerpeptidsequenz (βAPPRM-TG) aufgebaut.
Nach Anknüpfung der geschützten Glutaminsäure erfolgte die Synthese der
variablen Bibliothekspeptide nach dem Protokoll der Split-Mix-Synthese. Die
Anknüpfung von Boc-Lys(Alloc)-OH stellte den letzten Schritt im Aufbau der
Peptidkette dar. Die Syntheseeffizienz wurde durch UV-Messung aller Fmoc-
Entschützungsschritte verfolgt. Von der nun vorliegenden Vorläuferbibliothek aus
linearen Peptiden wurden die Allyl- und Alloc-Schutzgruppen entfernt. Daran
anschließend erfolgte die Cyclisierung der Peptidbibliothek bis im Kaiser-Test und
TNBS-Test keine freien Amine mehr nachzuweisen waren. Die Entschützung der
säurelabilen Schutzgruppen mit TFA/TIS/Wasser erfolgte immer unmittelbar vor dem
Einsatz im biologischen Test. Zur Lagerung wurde die mit Peptidylharz bestückte
Einwegspritze in einem mit Argon gefluteten Schraubdeckelglas im Kühlschrank
aufbewahrt. Da es zu unerwarteten Problemen bei der post-Screening Peptidsequen-
zierung kam, wurde eine identische Bibliothek nochmals auf größeren Harzkugeln
synthetisiert (TentaGel MB300 / 280-320 µm / 65500 Kugeln pro Gramm).
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