Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente
8 Experimenteller Teil
Die SPR-Messungen erfolgten an einem Biacore T100 Gerät (Biacore, Uppsala,
Schweden) unter Verwendung eines CM5-Sensorchips (ebenfalls von Biacore). Alle
Messungen erfolgten bei 25°C. Die Streptavidin-Immobilisierung erfolgte mittels
EDC/NHS-Aktivierung unter Verwendung der oben beschriebenen Lösungen analog
der im Handbuch [126] beschriebenen Vorgehensweise. Die Flussrate betrug
10 µl/min. Zur Immobilisierung des Liganden wurde eine Injektionszeit von 900
Sekunden gewählt. Zusätzlich zur Messzelle wurde eine Referenzzelle hergestellt.
Diese wurde analog der Bindungsmesszelle beladen, jedoch ohne Injektion des
Liganden. Nach erfolgreicher Streptavidin-Immobilisierung wurden mit einer
Flussrate von 40 µl/min und einer Injektionszeit von 90 Sekunden die
Verdünnungsreihen (0,3-700 µM bzw. 0,01-10 mM) der einzelnen Peptide
vermessen. Nach jeder Peptidinjektion erfolgte eine Regeneration der Oberfläche
durch Behandlung mit HBS-N Puffer für 300 Sekunden bei einer Flussrate von 40
µl/min. Zur Auswertung wurde das zum Gerät gehörende Programm Biacore T100
Evaluation Software (Version 1.1) verwendet. Bei allen herangezogenen Daten
handelt es sich um Differenzmesswerte (Signal der Referenzzelle subtrahiert vom
Signal der Bindungsmesszelle). Die erhaltenen Sensorgramme wurden durch
Anwendung der steady-state-affinity ausgewertet.
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