Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

4 Analytik
Unsere Wahl für den Linker fiel auf Methionin. (Die Verwendung von Methionin als
Sollbruchstelle wurde in Abschnitt 3.2 ausführlich beschrieben und diskutiert). Auch
in diesem Peptid wurde die bereits erwähnte Massenspacersequenz -βAla-Pro-Pro-
Arg- eingebaut. Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 75 erfolgte nach
Standard-Fmoc-SPPS-Bedingungen am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf
wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach
Abspaltung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe erfolgte die Seitenkettencyclisierung
nach Aktivierung mit PyBOP. Mit der abschließenden Testabspaltung wurde das
Peptid charakterisiert.
Mit dem nun vorliegenden Cyclopeptid 77 wurden erste partielle Edman-Abbau-
Experimente durchgeführt. Zunächst wurde mit einer größeren Menge Harz (2 mg,
ca. 1.600 Harzkugeln) begonnen, um eventuelle Probleme der Nachweisempfindlich-
keit zu umgehen. Im ersten Schritt erfolgte die Abspaltung der noch am Peptid
vorhandenen säurelabilen Schutzgruppen (Boc und Pbf) durch eine ausführliche
TFA-Behandlung der Harzkugeln. Daraufhin wurde das Harz ausgiebig mit
Dichlormethan, Acetonitril und Wasser gewaschen. Das anschließende Waschen der
Kugeln mit Pyridin sowie einer Mischung aus gleichen Teilen Pyridin, Wasser und
0,1% Triethylamin garantierte einen unprotonierten N-Terminus. Nur wenn am
N-Terminus ein freies Elektronenpaar vorliegt, kann der nucleophile Angriff an das
Edman-Reagenz (PITC) erfolgen. Für die Kupplung wurde zum Harz eine unmittelbar
vor dem Gebrauch hergestellte Lösung von PITC und FmocOSu in Pyridin (ca. 30:1)
aufgezogen. Das festphasengebundene Peptid lag nun also als Phenylthiocarbamat-
Derivat bzw. mit Fmoc gecappt vor. Der Kupplung folgten einige Waschschritte mit
Pyridin, Acetonitril und Dichlormethan zum Entfernen der überschüssigen
Reagenzien. Durch Behandlung des Peptidylharzes mit TFA erfolgte die Abspaltung
der N-terminalen Aminosäure, so dass ein „neuer“ freier N-Terminus vorliegt. Beim
ersten Abbauschritt, der Ringöffnung, verbleibt das N-terminale Aminosäurederivat
über die Seitenkettenverbrückung im Molekül erhalten. Bei den darauffolgenden
Zyklen wurde die jeweils entstehende Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure aus dem
Molekül gespalten und anschließend weggewaschen. Durch Waschen der Harz-
kugeln und Einstellen basischer Bedingungen begann ein neuer Abbauzyklus.
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