Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
8.3.10.4 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids
SRBS-pY230
Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O t Bu)-OH beladen
(Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der
ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM 15 min
länger UV.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen
(Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid
(Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc)
wurde die vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine
wurden verwendet: Fmoc-Glu(O t Bu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH und
Fmoc-Lys(Boc)-OH.
Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu
wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.
Fmoc-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (122→)
MALDI-TOF-MS: 1105,3 [M+H] +
Berechnet: C53H73N10O16 + (exacte 1105,5201 m/z, avarage 1106,2036 m/z)
Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte manuell. Die Abspaltung der
N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 10, wobei deren Erfolg stets
mittels UV-Quantifizierung überprüft wurde. Die Anknüpfung der Aminosäure-
bausteine wurde wie in AAV 3 beschrieben durchgeführt. Zur Aktivierung wurde
PyBOP/ HOBt verwendet. Die letzten beiden Aminosäuren (Arg und Pro) wurden mit
PyAOP/ HOAt aktiviert. Nach dem Aufbau der Peptidkette wurde nach AAV 9 das
Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit
Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.
SRBS-pY230
SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH
Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 35-60% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 10,9 min
ESI-MS: 2364,4 m/z [M+H] 1+
Ausbeute: 14% (6,4 mg)
Berechnet: C104H152N23O34PS2 + (exacte 2363,0124 m/z, avarage 2364,5645 m/z)
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