Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

Gelatine Blocking-Puffer
8 Experimenteller Teil
10 mg Gelatine wurden in einem Messzylinder eingewogen und in 8 ml Wasser auf
einem Wasserbad 10 min gerührt. Anschließend wurde mit Wasser auf 10 ml
aufgefüllt. Die Lösung wurde für jedes Screening frisch hergestellt.
Färbelösung
Zum Anfärben der Harzkugeln wurde eine BCIP/NBT-Färbetablette in 10 ml Wasser
aufgelöst und die entstandene Lösung direkt eingesetzt.
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat
Das gekaufte Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat Lyophilisat (1mg) wurde
in 1 ml Wasser gelöst, in 20 aliquoten Teilen auf Caps verteilt und lyophilisiert. Die
gewünschte Verdünnung (1:10000 bzw. 1:1000 bezogen auf 1 mg/ml) wurde
unmittelbar vor den Versuchen durch Verdünnung mit 0,1% Tween, 0,1% Gelatine in
PBS-Puffer hergestellt und nicht verwendete Lösungen wurden verworfen.
Guanidinium-Lösung
57,32 g Guanidinium*HCl (6 M) wurden in 80 ml Wasser gelöst und mit 1N HCl auf
pH 1,0 eingestellt. Anschließend wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2
200 mg TentaGel (130 µm, 0.32 mmol/g, 64 µmol) wurden in einer 5 ml-Spritze mit
PE-Fritte eingewogen und mit 3 ml DMF 10 min quellen lassen. 4 eq. Biotin-N-
Hydroxysuccinimidoester (Biotin-NHS) (87,4 mg, 256 µmol) und 8 eq. DIPEA (87,6
µl, 512 µmol) wurden in 2 ml DMF gelöst, zum Harz aufgezogen und 4 h gekuppelt.
Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit Kaiser- und TNBS-Test (siehe AAV 4)
überprüft. Nach dem Waschen mit DMF (5x1 min) erfolgte ein Capping mit
Essigsäureanhydrid (10% in DMF). Nach erneutem Waschen mit DMF (10x1 min)
und DCM (5x1 min) wurde das Harz im Ölpumpenvakuum getrocknet.
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