Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

4 Analytik
In Anbetracht der Inhomogenität der Fragmentierungsstellen und der geringen
Probenmenge wurde ein rein massenspektrometrischer Ansatz zur Sequenzierung
der Hitbead-gebundenen Peptide verworfen.
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED)
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Peptidsequenzen wurde bereits 1950
von dem schwedischen Wissenschaftler Pehr Edman veröffentlicht. [86, 87] Bei diesem
cyclischen Prozess, der unter dem Namen Edman-Abbau bekannt geworden ist,
handelt es sich um eine Reaktionskaskade, bei der in jedem Reaktionszyklus vom
N-terminalen Ende der Peptidkette eine endständige Aminosäure abgespalten und
identifiziert wird. Die Reaktion besteht aus drei voneinander gut abgegrenzten
Schritten: Kupplung, Spaltung und Konvertierung (Abb. 4.7). Im ersten Schritt, der
Kupplung, wird unter leicht basischen Bedingungen (pH 9) an die freie
N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das Edman-Reagenz Phenylisothiocyanat
(PITC) gekoppelt. Es entsteht ein disubstituierter Thioharnstoff, das Phenyl-
carbamoylpeptid (PTC-Peptid). Nach Entfernen des überschüssigen PITC wird das
getrocknete PTC mit wasserfreier Säure, üblicherweise TFA, behandelt. Dabei wird
durch einen nucleophilen Angriff des Schwefelatoms an der Carboxylgruppe der
ersten Peptidbindung die erste Aminosäure als heterocyclisches Derivat, eine
Anilinothiazolinon-(ATZ)-Aminosäure, abgespalten. Befindet sich ein Sauerstoffatom
an der Stelle des Schwefels, wurde also ein Isocyanat anstelle des PITC eingesetzt,
kann das Reagenz zwar auch an die Aminogruppe des Peptids kuppeln, ist aber
nicht zur Ringbildung, und damit auch nicht zur Abspaltung der Aminosäure, fähig.
Im letzten Schritt, der Konvertierung, erfolgt nach der Hydrolyse zur
Phenylthiocarbamoylsäure eine Umlagerung unter Ringschluss zum 3-Phenyl-2-
thiohydantoin (PTH)-Derivat. Die PTH-Aminosäuren können mittels RP-HPLC
identifiziert werden. Durch Optimierung, Automatisierung und technische Weiterent-
wicklungen liegt die Empfindlichkeit heutiger Mikrosequenzierer im femto-molaren
Bereich. [45]
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