Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

3 Sollbruchstellen
Zur Erstellung der Eichgeraden wurden pro Harz zwei definierte Mengen
Peptidylharz eingewogen, abgespalten und anschließend pro Einwaage eine
Peptidlösung erstellt. Daraus wurden HPLC-Läufe mit 25, 30 und 50 µl
Injektionsvolumen durchgeführt. Dabei wurde angenommen, dass beide Linker
während der säureinduzierten Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen stabil sind
und dass die abschließende Spaltung des Peptids vom Harz quantitativ verläuft.
Beim näheren Betrachten der Eichgeraden (Abb. 3.22) fällt auf, dass die ermittelten
Werte, die aus derselben Lösung, aber unterschiedlichen Injektionsvolumina
entstanden sind, sehr gut auf einer Gerade liegen. Zwischen den verschiedenen
Lösungen gibt es jedoch deutliche Unterschiede, vor allem im Fall der beiden
Glycolamidester-Harz Datenreihen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass der Fehler
nicht bei der HPLC-Anlage (Präzision der Probeninjektion, Ermittlung der
Peakfläche), sondern bereits zuvor gesucht werden muss. Hier gibt es viele mögliche
Fehlerquellen, wie das ungenaue Einwiegen (verursacht zum Beispiel durch fehlende
Wägepräzision und/oder statische Aufladung), eine nicht hundertprozentig
reproduzierbare Abspaltreaktion und die anschließende Probenpräparation
(Löslichkeit, Pipettieren). Da das Ziel eine Abschätzung der Linkerstabilität bei
verschiedenen Reaktionsbedingungen war, liegen die Messwerte dennoch in einem
verwertbaren Rahmen. Aus den erhaltenen Werten kann abgelesen werden, ob die
Behandlung mit den getesteten Bedingungen problematisch ist. In Folge dessen
kann abgeschätzt werden, ob mit einem Verlust des Peptids von der festen Phase zu
rechnen ist.
Der Blick in Tabelle 2 zeigt, dass beide Linker nicht die gewünschte Stabilität
besitzen. Der größte Verlust des Peptids vom Harz wurde in beiden Fällen bei der
Behandlung mit TBS-Puffer beobachtet. Während eines typsichen Screenings-
prozesses findet unter diesen Bedingungen üblicherweise eine durch AP-katalysierte
enzymatische Anfärbereaktion zum Visualisieren der Rezeptor-Ligand-
Bindungsreaktion statt. Um dieses Problem zu umgehen, könnte man statt eines AP-
Konjugats ein Peroxidase-Konjugat verwenden, wodurch die Änderung des pH-
Wertes ins Alkalische überflüssig werden würde. Neben der Instabilität bei TBS-
Puffer, weisen beide Linker eine Labilität gegenüber TFA auf. Im Einzelnen
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