Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5 Anwendung der Methode
Abb. 5.5: Mikroskopausschnitte während der Optimierung des Screenings.
Die erste Reihe zeigt optimale Bedingungen (Versuch 5): a) Positivkontroll-
peptid, b) Biotin, c) Negativkontrollpeptid, d) TentaGel.
Die untere Reihe zeigt: e) Positivkontrollpeptid mit altem SA-AP-Konjugat
(Versuch 4), f) Biotin mit altem SA-AP-Konjugat (Versuch 4), g) Negativ-
kontrollpeptid mit zu wenigen Waschschritten (Versuch 2), h) Positivkontroll-
peptid mit zu geringer SA-AP-Konjugatkonzentration.
Beim genaueren Betrachten der Kugeln unter dem Stereomikroskop fiel auf, dass die
beiden Positivkontrollen mit einem hellvioletten Niederschlag überzogen waren;
erwartet wurde jedoch ein tiefviolettschwarzer Überzug. Ein möglicher Grund dafür
könnte eine zu kurze Reaktionszeit der Farbreaktion sein. Desweiteren fielen bei
beiden Negativkontrollen lokale Ablagerungen auf den Kugeln auf, was auf
unspezifische Bindungen hinweisen könnte (Abb. 5.5 Bild g). Diese sollten durch
eine Erhöhung der Waschschritte nach der Inkubation mit SA-AP-Konjugat behoben
werden können. Folglich wurde im dritten Versuch die Farbreaktionszeit auf
30 Minuten erhöht und die Waschschritte nach der SA-AP-Konjugatinkubation je
fünfzehnmal wiederholt. Die lokalen Ablagerungen bei beiden Negativkontrollen
wurden mit der Erhöhung der Waschschritte behoben. Die Anfärbung der
Positivkontrolle nahm zu, war aber immer noch nicht zufriedenstellend. Ein weiterer
Grund für eine nicht optimal verlaufende Farbreaktion könnte der pH-Wert während
der enzymkatalysierten Reaktion sein. Im Versuch 4 wurde deshalb der pH-Wert auf
9,5 erhöht. Dies erbrachte jedoch keine Verbesserung. Im fünften Versuch wurde
neu gekauftes SA-AP-Konjugat verwendet. Der pH-Wert des TBS-Puffers wurde auf
pH 9.0 gesenkt, da ein pH-Wert von 9,5 über der Grenze des Pufferbereichs
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