propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

Capítulo2: Hidrólisis enzimática de aislados proteicos de amaranto
2.1.3. Hidrólisis del AI y medida del grado de hidrólisis
Las distintas muestras se prepararon por hidrólisis enzimática del aislado
proteico de amaranto con alcalasa (proteasa de B. Licheniformis; cat# P4860; Sigma
Chemicals, EE.UU) en una concentración de 0,8 μL de enzima por cada gramo de
aislado, o con tripsina (10600 BAEE unidades / mg sólido; Sigma Chemicals,
EE.UU) en una concentración de 10 mg de enzima por gramo de aislado. El AI se
dispersó en buffer fosfato, pH 7,8; fuerza iónica 0,1 M, en una concentración de
10 mg/ml y se agitó durante 1 h a 37 °C; luego se agregó la enzima. La hidrólisis
se llevo a cabo durante 20 min con tripsina y durante 20 y 240 min con alcalasa.
La reacción de hidrólisis se detuvo por calentamiento en un baño de agua a 85 °C
durante 10 min. Transcurrido ese tiempo la suspensión se enfrió en un baño de
hielo, se la congeló y liofilizó. Luego de liofilizada se la almacenó a 4 °C hasta su
utilización.
El grado de hidrólisis (%GH) alcanzado se determinó utilizó el método del ácido
trinitrobencenosulfónico (TNBS) (Adler-Nissen 1979) que reacciona con los
grupos amino libres pudiéndose cuantificar colorimétricamente.
El aislado proteico hidrolizado con tripsina mostró un %GH de 2,2 (TH2.2),
mientras que los aislados hidrolizados con alcalasa mostraron un %GH de 1,7
(AH1.7) y 9,5 (AH9.5) para 20 min y 240 min de hidrólisis respectivamente.
La caracterización química de los hidrolizados (TH2.2, AH1.7 y AH9.5) mostró
un valor de cenizas de 28,2 % ± 0,1 % en todas las muestras hidrolizadas. Este
valor es superior al obtenido con AI debido a las cenizas que aportan el buffer
utilizado para suspender el aislado antes de llevar a cabo la hidrólisis.
2.1.4. Soluciones buffer utilizadas
En las distintas experiencias se utilizaron las siguientes soluciones buffer.
Buffer pH 2,0: H3PO4 0,0183 M; Na H2PO4 0,0166 M; NaCl 0,0304 M; μ 0,05.
Buffer pH 4,0: HCH2COOH 0,0288 M; HCH2COONa 0,0061 M; NaCl 0,0409 M; μ
0,05.
Buffer pH 6,3: NaH2PO4 0,0286 M; Na2HPO4 0,0063 M; μ 0,05.
Buffer pH 8,0: Tris HCl 0,023 M; Tris base 0,0119 M; NaCl 0,024 M; μ 0,05.
A todas las soluciones se les agregó azida de Na en una concentración de 0,015 %
para evitar la proliferación microbiana.
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