propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto
modificaciones en la fluorescencia que producen agregados de sonda a una
solución proteica.
Las muestras fueron disueltas en buffer A, centrifugadas a 15000 g por 20 min a
20 °C y diluidas para obtener una concentración final proteica entre 0,10 y 0,15
mg/ml. También se preparó una solución de ANS 10 mM en buffer A. Se
agregaron cantidades crecientes de la solución de ANS a una cubeta conteniendo
el blanco de buffer A y a una cubeta conteniendo la muestra de proteína. Las
concentraciones de ANS barridas durante el ensayo estuvieron comprendidas
entre: 0 y 100 μM. Para cada una de las concentraciones de ANS utilizadas, se
midió la intensidad de fluorescencia de la muestra en contacto con la sonda. Para
realizarlo la cubeta conteniendo la mezcla muestra-blanco/ANS fue excitada con
UV a una longitud de onda de 350 nm y el espectro de emisión de la muestra se
leyó entre 450 y 540 nm. Para estos experimentos se contó con un
espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS 50B (Perkin-Elmer Corp.,
Inglaterra). Primero se procedió a restar al espectro de emisión de cada muestra a
cada una de las concentraciones de ANS con el de su blanco correspondiente a la
misma concentración de ANS, y se graficó la intensidad de fluorescencia
detectada a 470 nm, ya que en esa longitud de onda se presentó el máximo de
emisión del complejo proteína-ANS, en función de la concentración de ANS en
μM. Se ajustaron los datos obtenidos con la ecuación:
(2) IF = A x ANS / (B + ANS)
Los valores de A y B se obtuvieron utilizando el software ORIGIN Pro 8
(OriginLab Co; EE.UU) que utiliza métodos numéricos por iteraciones. “A” es la
intensidad de fluorescencia máxima para la concentración de proteína empleada
cuando la superficie de la proteína está completamente saturada con la sonda
(IFmax). La hidrofobicidad superficial H0 es proporcional a la máxima intensidad
de fluorescencia obtenida por mg de proteína y fue estimada a partir de la
ecuación anterior realizando el cociente entre “A” y la concentración de proteína
calculada para cada muestra expresada en mg/ml.
(3) H0 = A / conc. prot.
La concentración proteica se determinó por el método de Lowry (ver sección
1.1.5.).
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