propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto
durante 1 h a temperatura ambiente. Luego fueron centrifugadas a 15000 g
durante 20 min a 25 °C. El sobrenadante fue filtrado a través de filtros de nylon
de 0,22 μm de poro y el filtrado se inyectó en el equipo de FPLC (Pharmacia LKB,
Suecia).
1.1.8.3. Desarrollo
Las cromatografías se realizaron a temperatura ambiente utilizando una columna
Pharmacia LKB (Suecia), Superose 6B HR 10/30. El buffer A, previamente filtrado
a través de filtros de celulosa con diámetros de poro de 0,22 μm, fue utilizado
para suspender la muestra y para el desarrollo de la corrida cromatográfica. Para
equilibrar la columna, se pasó un volumen del buffer equivalente al de dos
columnas (50 ml). La velocidad de flujo seleccionada fue de 0,2 ml/min y la
misma se suministró mediante una bomba Pharmacia LKB P-500, la presión
promedio de las cromatografías fue de 0,3 MPa. Se inyectaron entre 200 y 500 μl
de muestras en cada corrida. Se realizó o no una colección automática de las
fracciones a medida de que salían de la columna (0,3 ml) empleando el colector
FRAC-100 (Pharmacia LKB).
1.1.8.4. Calibración
La calibración de la columna fue realizada utilizando un kit de calibración para
cromatografía de filtración en gel de alto peso molecular GE-Healthcare (EE.UU).
El volumen muerto (V0) se midió con azul dextrano, y las proteínas de peso
molecular conocido utilizadas fueron las siguientes:
ribonucleasa (13,7 kDa),
ovoalbúmina (43 kDa),
albúmina (67 kDa),
alcohol deshidrogenasa (150 kDa),
tiroglobulina (669 kDa).
Los patrones se disolvieron en buffer A en una concentración de 4 mg/ml y
fueron eluídos de la columna con el mismo caudal que las muestras.
Luego se obtuvo una curva de calibración relacionando el logaritmo de la masa
molecular (en kDa) con el KAV, siendo KAV:
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