propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto
1.1.7.2. Determinación por medida de la fluorescencia intrínseca
El espectro de fluorescencia intrínseca se atribuye a los residuos aromáticos de la
proteína: triptófano, tirosina y fenilalanina. El que presenta menos
inconvenientes para su medida es el triptófano. El espectro de emisión del
triptófano es característico si se excita a 295 nm y depende del ambiente que
rodea a la molécula dentro de la posición en la proteína.
En una cubeta de 3 ml se agregó el volumen necesario de cada una de las
muestras disueltas en buffer A para obtener una concentración proteica dentro
de la cubeta de 0,05 mg/ml y se completó el volumen a 3 ml con el mismo buffer.
Se midió el espectro de emisión de la muestra de 310 a 550 nm excitándola a
295 nm.
Cuando los triptófanos se encuentran más expuestos al ambiente hidrofílico la
longitud de onda del máximo del espectro de emisión se corre a valores mayores
(≅ 350 nm) y además la intensidad de fluorescencia (IF) disminuye. La exposición
de triptófano (residuos hidrofóbicos) sugiere la presencia de una mayor cantidad
de residuos hidrofóbicos en la superficie proteica y por lo tanto mayor
hidrofobicidad superficial.
1.1.8. Cromatografía rápida de proteínas en medio líquido
(FPLC)
1.1.8.1. Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular.
En este tipo de cromatografía la fase estacionaria está constituida por partículas
de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa en el tamaño de las
partículas. Las proteínas más grandes que no pueden penetrar en los poros de las
partículas de la matriz de filtración son eluidas con más rapidez que las
proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas y siguen un
camino más tortuoso y más largo. El tamaño de los poros internos depende de la
naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a proteínas por debajo
de un determinado peso molecular.
1.1.8.2. Preparación de las muestras
En el caso de los aislados nativos las muestras liofilizadas se suspendieron en
buffer A en una concentración de 1 mg/ml y se agitaron en agitador magnético
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