propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

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1.1.3. Reactivos Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto Buffer A: NaH2PO4 0,0056 M; Na2HPO4 0,0343 M; NaCl 0,4 M. A la temperatura a la que se realizaron los ensayos el pH del buffer A fue 7,5 y la fuerza iónica (μ) 0,5. Para impedir la acción de bacterias en la solución se utilizó azida de sodio en una concentración de 0,01 % p/v. 1.1.4. Tratamiento ácido de los aislados Los aislados (SN y AN) fueron suspendidos individualmente y también mezclándolos en proporciones iguales (MN), en una solución de HCl 0,01 N, en una concentración de 10 mg/ml. El pH se ajustó a 2,0 con HCl 2 N. las dispersiones se mantuvieron con agitación constante a temperatura ambiente durante 3 h. Posteriormente fueron diluidas 9 veces con buffer A, el pH se ajustó a 7,5 y se completó con el mismo buffer hasta una concentración de 1 mg/ml. Se siguieron agitando durante 3 h más a temperatura ambiente y se llevaron a cámara de 4 °C durante 18 h antes de usar. Las muestras resultantes luego del tratamiento ácido se denominaron ST, AT y MT dependiendo si provenían de SN, AN y MN respectivamente. 1.1.5. Solubilidad La cantidad de proteína soluble fue determinada por el método de Lowry (Lowry, Rosebrough y col. 1951). Este método se basa en el dosaje colorimétrico de productos de la reducción a pH alcalino del reactivo fosfotungtomolibdénico por los aminoácidos aromáticos de la proteína. Los productos de reacción toman un color azulado y la absorbancia se mide a una longitud de onda de 750 nm Para realizar las medidas de solubilidad las muestras nativas fueron dispersadas en buffer A en una concentración de 1 mg/ml y se agitaron durante 1 h a 20 °C. A las muestras tratadas por ácido se les realizó el ensayo al finalizar el tratamiento ácido anteriormente descripto. Todas las muestras se centrifugaron a 15000 g durante 15 min a 20 °C. Inmediatamente de finalizada la centrifugación se tomó una alícuota del sobrenadante para conocer su contenido de proteína. Para la realización de la curva de calibración se utilizó como proteína patrón albúmina de suero bovino (Sigma Chemical Co., nro. de cat. A-3350, EE.UU) disuelta en el mismo buffer que la muestra. Las lecturas de absorbancia de las distintas 41
Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto fracciones proteicas se realizaron en un espectrofotómetro Beckman DU 650 (Beckman Co, EE.UU), a una longitud de onda de 750 nm. La solubilidad es expresada como: (1) S% = Ps × 100 / Pin Siendo Ps la concentración de proteína en el sobrenadante y Pin la concentración de proteínas inicial. 1.1.6. Electroforesis 1.1.6.1. Aspectos teóricos y técnicas La electroforesis es una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la separación y caracterización de proteínas. La movilidad electroforética de una proteína depende de su carga neta (las proteínas presentan carga cuando se encuentran a un pH diferente de su punto isoeléctrico) así como también de su tamaño y conformación. Los soportes utilizados para la electroforesis se dividen en soportes inertes (acetato de celulosa, sílica gel, papel) e interactivos (azarosa, almidón y poliacrilamida). Los interactivos ayudan en la separación debido a su porosidad, actuando como tamices. Los geles de poliacrilamida son los más utilizados debido a las ventajas que presentan como son alta reproducibilidad, estabilidad (a pH, temperatura, fuerza iónica), transparencia, elasticidad, porosidad controlable, compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos e inercia química. La matriz de poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilen-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada, variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés polyacrylamide gel electrophoresis), probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del tensioactivo dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tanto para analizar proteínas, como para 42
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