propiedades estructurales y funcionales de preparados proteicos de ...

1.1.6.3. SDS-PAGE
Capítulo 1: Tratamiento ácido de aislados de soja y amaranto
Se utilizaron geles de poliacrilamida de concentración constante de acrilamida
12% p/v con gel apilador o de stacking de concentración de acrilamida de 4% p/v
(Petruccelli y Añón 1994).
Los patrones de masa molecular utilizados contenían: fosforilasa b (94 kDa);
seroalbúmina bovina (67 kDa); ovoalbúmina (43kDa); anhidrasa carbónica
(30 kDa); inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y α-lactoalbúmina (14,4 kDa) (GE-
Healthcare EE.UU). Las proteínas patrón fueron solubilizadas en 200 μl de buffer
de muestra desnaturalizante con 2-ME y sometidas al mismo tratamiento que se
aplicó a las muestras. Se construyeron curvas de calibración relacionando el
factor de distancia de las distintas proteínas (Rf) con el logaritmo de su peso
molecular. Los pesos moleculares de los polipéptidos son el resultado de tres
determinaciones como mínimo. Rf = DX/DF (DX: distancia recorrida por el
polipéptido x y DF: distancia recorrida por el frente de corrida).
1.1.6.4. SDS-PAGE en condiciones reductoras
Se realizó del mismo modo que la electroforesis desnaturalizante, con el
agregado de 2-mercaptoetanol al buffer de muestra. Las proteínas patrones de
masa molecular empleadas fueron las mismas que para el SDS-PAGE sin
2-mercaptoetanol.
1.1.6.5. N-PAGE
Para estas electroforesis se empleó el mismo sistema buffer que para las corridas
desnaturalizantes pero sin el agregado de SDS. Para todas las electroforesis en
estas condiciones se utilizaron geles en un gradiente de concentración de
acrilamida de 4-15%.
1.1.6.6. Electroforesis bidimensionales (N-PAGE → SDS-PAGE)
Luego de correr la primera dimensión (geles de 1 mm de espesor) se cortó la
porción del gel correspondiente a una calle con la proteína a analizar y se la
sumergió en 30 ml de buffer de tratamiento (descripto previamente),
manteniéndola a 55 °C durante 30 min con dos cambios de la solución. La
porción de gel tratada se colocó sobre el gel de la segunda dimensión de 1,5 mm
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