HBV'de Tedavi - EKMUD
HBV'de Tedavi - EKMUD
HBV'de Tedavi - EKMUD
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Antimikrobiyal Direnç:<br />
Direnç Saptanmasında Kullanılan Moleküler Yöntemler<br />
SPM-1 ve GIM-1) genlerinin ise özellikle sınıf-1<br />
integronlar üzerinde baskın olduğunu ortaya<br />
koymuştur.<br />
Streptococcus pneumoniae’da penisilin direnci<br />
giderek artmaktadır. Penisilin G diski ile yapılan<br />
fenotipik direnç testlerinde güçlükler yaşandığından<br />
bu amaçla oksasilin diski kullanılmaktadır.<br />
Ancak yapılan çalışmalarda, oksasilin diski<br />
kullanılarak yapılan disk difüzyon testlerinde<br />
dirençli bulunan suşların da, mutlaka dilüsyon<br />
yöntemleriyle doğrulanması gerektiği bildirilmektedir.<br />
S. pneumoniae’da altı penisilin bağlayan<br />
protein (PBP) bulunmaktadır. Bunlardan;<br />
PBP-1a, PBP-2b ve PBP-2X’i kodlayan genlerde<br />
oluşan “mozaik mutasyonlar” penisilin direncine<br />
neden olmaktadır. Gillespie ve arkadaşlarının<br />
yaptığı bir çalışmada; dirence neden olan<br />
mutasyonların varlığı, PCR-RFLP (restriction<br />
fragment lenght polymorphism) yöntemi ile<br />
araştırılmıştır. Bu yöntemde, PCR ürünleri HinfI<br />
enzimi ile kesilerek oluşan fragmanların büyüklüğüne<br />
ve sayısına göre penisilin direncine<br />
neden olan mutasyonlar belirlenmiştir. PCR-<br />
RFLP yöntemi, Helicobacter pylori’de klaritromisin<br />
(23S rRNA genindeki nokta mutasyonlar),<br />
Salmonella enterica serovar Typhi’de florokinolon<br />
direnci (gyrA genindeki nokta mutasyonlar)<br />
ve Serratia marcescens GSBL tiplerinin<br />
tespit edilmesi gibi daha birçok farklı çalışmada<br />
kullanılmıştır.<br />
Farklı antimikrobiyal direnç genlerini aynı anda<br />
saptamak için, tek reaksiyonda birden fazla hedefin<br />
çoğaltılmasına olanak sağlayan multipleks<br />
PCR yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin<br />
kullanımı ile; hedef DNA, zaman ve maliyetten<br />
kazanç sağlanmaktadır. Özellikle dirençten<br />
sorumlu birden fazla gen olduğunda bu PCR yöntemi<br />
tercih edilmektedir. En çok antimikrobiyal<br />
direnç araştırılan bakterilerden biri de vankomisine<br />
dirençli enterokoklardır Vankomisine dirençli<br />
enterokokların, kültür ve duyarlılık testleri<br />
kullanarak saptanması MRSA’ya oranla daha zordur.<br />
Özellikle düşük düzeyde direnci saptamak<br />
bu bakterilerde daha güçtür. Ayrıca, karışık floralı<br />
örneklerden, fenotipik yöntemlerle doğru<br />
tanımlama yapmak zaman alıcıdır (4-6 gün).<br />
Depardieu ve arkadaşları yaptıkları çalışmada;<br />
stafilokok ve enterokoklardaki vankomisin<br />
direnç genlerini araştırmak için multipleks PCR<br />
yöntemini kullanmışlardır. Geliştirdikleri yön-<br />
10<br />
temde 10 farklı primer çiftini tek bir reaksiyonda<br />
kullanarak, aynı anda hem bu bakterilerin<br />
tür düzeyinde ayırımını yapmış (S. aureus, S.<br />
epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus<br />
faecium), hem de altı farklı glikopeptid direncini<br />
(vanA-E) tespit edebilmişlerdir. Multipleks PCR<br />
yöntemleri geliştirilirken, primerlerin benzer<br />
erime derecelerine sahip ve birbirleri ile etkileşme<br />
olasılıklarının düşük olmasına dikkat edilmelidir.<br />
Ayrıca, amplifikasyon ürünlerinin, jel<br />
elektroforezi ile birbirlerinden açık bir şekilde<br />
ayırt edilebilir olmaları gereklidir.<br />
“Real-time” PCR yöntemlerinin geliştirilmesi,<br />
tanısal mikrobiyolojinin her alanında olduğu<br />
gibi antimikrobiyal direnç genlerinin tespitinde<br />
de birçok avantajı beraberinde getirmiştir.<br />
Klasik nükleik asit çoğaltma yöntemlerinden<br />
daha hızlı ve daha duyarlı olan “real-time” PCR<br />
yöntemlerinde, amplikonun analizi için reaksiyon<br />
tüpünün açılması gerekmediğinden çapraz<br />
kontaminasyon riski daha azdır. Bu yöntemlerde<br />
çoğaltılan amplikonlar; floresan işaretli probların<br />
kullanıldığı TaqMan, molecular beacons,<br />
FRET (floresans rezonans enerji transfer),<br />
Scorpions, AmplifluorTM gibi yöntemler ile<br />
özgül olarak, SYBR Green I, YO-PRO-1 ve etidyum<br />
bromür gibi DNA’ya bağlanabilen boyalar<br />
ile özgül olmayarak gösterilebilir. Farklı floresan<br />
moleküllerin, farklı dalga boylarında ışıma<br />
yapmaları birden fazla hedefin saptanabildiği<br />
multipleks PCR uygulamalarının yapılmasına<br />
da olanak sağlar. Kazuko ve arkadaşları, geliştirdikleri<br />
“real-time” multipleks PCR yöntemi ile<br />
pnömokoklarda, penisilin ve makrolid direncini<br />
birlikte göstermişlerdir. Bu çalışmada, penisilin<br />
direncine neden olan pbp1a, pbp2b, pbp2X genleri<br />
ile makrolid direncine neden olan ermB<br />
(23S rRNA metilasyonu) ve ermA (aktif pompa<br />
sistemini kodlar) genleri, aynı reaksiyonda gerçek<br />
zamanlı olarak tespit edilmiştir.<br />
DNA dizi analizi yöntemleri rutin mikrobiyoloji<br />
laboratuvarlarında; bakteri tanımlanması ve<br />
direnç genlerinin araştırılmasında kullanılmaktadır.<br />
Günümüzde Sanger’in zincir sonlandırma<br />
temeline dayanan, dideoksinükleotid yöntemi<br />
yaygındır. Son yıllarda geliştirilen, hızlı bir baz<br />
dizi analizi yöntemi olan “pyrosequencing” sistemi,<br />
özellikle tek nokta mutasyonuna bağlı<br />
antimikrobiyal direncin saptanmasını kolaylaştırmıştır.<br />
DNA dizi analizi ile antimikrobiyal<br />
3. Türkiye <strong>EKMUD</strong> Bilimsel Platformu
Change language