francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

3.2.2 Sequenciamento dos genes MLH1, MSH2 e ROBO1
Como descrito acima, em um subconjunto de casos foi realizada a
reação de sequenciamento direto de acordo com a metodologia de Sanger:
(1) amplificação dos éxons dos genes MLH1 e MSH2 e purificação
enzimática do amplicon, (2) incorporação dos ddNTPs e (3) precipitação dos
produtos obtidos. Os genes MLH1 (GeneBank NM_000249.3), MSH2
(GeneBank NM_000251.1) e ROBO1 (GeneBank NM_002941.3) foram
divididos em 20, 16 e 26 fragmentos correspondentes aos 19, 16 e 31
éxons, respectivamente. Os pares de iniciadores foram desenhados nas
regiões intrônicas, com o objetivo de verificar a presença de mutações nos
éxons e regiões de splicing. Na Tabela 5 estão descritos os iniciadores do
gene ROBO1. Os iniciadores dos genes MLH1 e MSH2 foram
disponibilizados pelo laboratório de diagnóstico molecular, coordenado pela
Dra Dirce Maria Carraro.
As reações de sequenciamento dos genes MLH1 e MSH2 foram
realizadas em todos os pacientes deste estudo. Mutações no gene ROBO1
foram investigadas nas pacientes SM37 e SM56 e seus familiares (SM37-2,
SM37-2, SM37-4, SM37-5, SM56-2 e SM56-3).
Na PCR foram utilizados 5 µM de cada iniciador (forward e reverse),
10 µL de Master Mix (Promega) e 25 ng de gDNA. As condições da PCR
estão descritas na Tabela 6.
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