francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

(tissue microarray - TMA), contendo amostras independentes de carcinomas
mamários (313 casos) e colorretais (279 casos), selecionados a partir do
arquivo do Hospital A.C. Camargo.
As lâminas contendo os cortes em parafina foram submetidas a
tratamento com xilol para a retirada da parafina e, em seguida, hidratadas
em soluções com concentrações decrescentes de etanol. A recuperação
antigênica foi realizada segundo a padronização do anticorpo selecionado. O
bloqueio da peroxidase endógena foi feito com solução de peróxido de
hidrogênio a 3% com três trocas. Após o bloqueio da peroxidase, foi
realizado o bloqueio da avidina/biotina (DAKO ® Biotin Blocking System) e
proteína (DAKO ® Protein Block Serum-Free). As reações de
imunoistoquímica foram realizadas utilizando anticorpos primários anti-
ROBO1 (ab7279, Abcam Inc, Cambrigde, MA) de acordo com as instruções
do fabricante. Após 30 min de incubação, as lâminas foram lavadas em PBS
(tampão salino fosfato) e incubadas por 30 min com o anticorpo secundário.
Em seguida, as mesmas foram incubadas por 30 min utilizando o sistema de
detecção de polímeros (Advanced TM HRP Link, Dako Cytomation, K0690,
Denmark). As reações foram realizadas a partir de soluções contendo 0,6
mg/mL de 3.3’-diaminobenzina tetrahidrocloreto (DAB, Sigma, St Louis, MO)
e 0,01% H2O2. As lâminas foram coradas com hematoxilina de Mayer
(Allkimia ® ), desidratadas e montadas com lamínula. As reações foram
acompanhadas de um controle positivo e dois controles negativos. O
controle positivo foi representado por um carcinoma de pulmão sabidamente
positivo para o anticorpo testado. E o primeiro controle negativo foi feito pela
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