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Tabela 7 - Categorização dos genes envolvidos em CNVs novas raras por CGH array quanto às classes funcionais. 1. Estrutura celular, motilidade e transporte Transporte Organização e estrutura intracelular Matriz extracelular, membrana e citoesqueleto Biogênese e organogênese citoplasmática Motilidade 2. Metabolismo celular Metabolismo de proteínas Metabolismo de DNA Metabolismo de RNA Metabolismo de lipídeos Metabolismo de carboidratos Metabolismo geral Regulação da transcrição 3. Crescimento, desenvolvimento e manutenção celular Homeostasia Diferenciação celular e tecidual Ciclo celular Morte celular 4. Comunicação celular Transdução de sinal Resposta a estímulo externo Adesão celular Sinalização célular a célula Reconhecimento celular 5. Função desconhecida 3.2.4 PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) O gene ROBO1 foi avaliado por qPCR para confirmar os resultados obtidos na análise dos dados de aCGH. Os iniciadores utilizados para a detecção do gene alvo ROBO1 foram desenhados a partir da sequência de DNA do gene em questão 41
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://genome.ucsc.edu/) pelo programa Primer-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). O programa Oligoanalyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer) foi utilizado para prever possíveis formações de estruturas secundárias (hairpins) e dímeros de iniciadores (homo e heterodímeros), que podem levar a redução da eficiência da reação. As sequências dos iniciadores para o gene alvo (tanto para a reação de validação como de mapeamento da alteração) e referência estão descritos na Tabela 6. Para a confirmação de perdas detectadas para sondas específicas no experimento de aCGH, foram desenhados dois pares de iniciadores. O iniciador 1 (P1), mapeado na região do íntron 4 e 5 do gene ROBO1, flanqueia a sonda S21 (A_16_P16292303), uma das quatro sondas alteradas envolvidas na perda identificada nesse gene. O iniciador 2 (P2), mapeado na região do éxon 4, flanqueia a sonda S26 (A_14_P133797), mapeada no éxon mais próximo da alteração identificada pela metodologia de CGH array (Tabela 8, Figura 2). Para esta análise, foram utilizadas DNA de duas pacientes (grupo 1: SM56 e grupo 2: SM37) que apresentaram a deleção, e de quatro familiares da paciente SM37 (SM37.2, SM37.3, SM37.4 e SM37.5). Com o objetivo de mapear a extensão da perda genômica identificada no gene ROBO1 por CGH array foram desenhados seis pares de iniciadores (P1 ao P6) flanqueando regiões intrônicas (anterior e posterior ao éxon 4), exônica e da região de splicing alternativo (Tabela 8, Figura 3). Para esta análise, foram avaliadas amostras de duas pacientes (grupo 1: SM56 e 42
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Anexo 3 - Critérios de Bethesda pa
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