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Tabela 6 - Condições da PCR para os genes MLH1, MSH2 e ROBO1.
Gene Éxons
MLH1
MSH2
ROBO1
Condições da PCR
35 ciclos (desnaturação a 95°C por 30 seg,
anelamento a T°C por 45 seg, extensão a 72°C
por 1 min)
E16 T= 51°C
E5 T= 55°C
E1, E2, E3, E4, E6,
E7-8, E9, E10,
E11, E12, E13,
E14, E15, E17,
E18, E19
T= 56°C
35 ciclos (desnaturação a 95°C por 30 seg,
anelamento a T°C por 45 seg, extensão a 72°C
por 1 min)
E4 T= 42°C
E2, E3, E10, E14,
T= 47°C
E16
E9 T= 50°C
E5, E7, E8, E11 T= 51°C
E6, E12, E13, E15 T= 52°C
E1 T= 59°C
35 ciclos (desnaturação a 95°C por 30 seg,
anelamento a T°C por 45 seg, extensão a 72°C
por 1 min)
E11 T= 55°C
E20-21 T= 56°C
E2, E3, E4, E5,
E6-7, E8, E9, E10,
E12-14, E15, E16,
E17, E18, E19,
T= 57°C
E22, E23, E24,
E25, E26, E27,
E28, E29, E30,
E31
Legenda - E: éxon; T: temperatura específica de melting.
O volume de 8,0 µL do produto amplificado foi purificado com a
enzima Exo-Sap I (USB/GE), com o intuito de remover os dNTPs e
iniciadores, não utilizados na reação de amplificação. A reação de
sequenciamento foi realizada com a adição de 1,5 µL 5x Sequencing Buffer
BigDye Terminator v1.1, v3.1, 5 µM do iniciador, 0,75 µL de BigDye®
Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), utilizando-se os
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