francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

por 2 horas e 65°C por 15 min. Foi realizada a purificação das amostras com
o intuito de remover as cianinas não incorporadas ao gDNA, utilizando-se
Illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns (GE Healthcare). A purificação foi
realizada de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação, os
gDNAs marcados foram quantificados em Nanodrop ND-1000
Spectrophometer com o objetivo de calcular a eficiência da reação de
marcação. A hibridação das amostras foi realizada segundo os valores de
eficiência descritos no protocolo da Agilent Technologies. Amostras dos
casos e de referência eram avaliados quanto a eficiência (Cy3 TM -dUTP: 25-
40 pmol/µL; Cy5 TM -dUTP: 20-35 pmol/µL) e combinados na razão de 1:1.
Em seguida, as amostras foram precipitadas em 19,5 µL de acetato
de amônio 3M, 300 µL de EtOH 100% gelado e 5 µL de Human Cot-
11mg/mL (Invitrogen, Life Technologies). Os mesmos permaneceram 10-20
min a temperatura de -80°C, seguido de centrifugação a 14.000 rpm por 30
min a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e foi adicionado 1 mL de EtOH
70% gelado, seguidos de homogeneização por inversão e centrifugação a
14.000 rpm por 15 min a 4°C. Após a retirada do sobrenadante, as amostras
marcadas permaneceram a 37°C por alguns minutos para secagem do
sedimento sendo adicionados 44 µL de TE Buffer, 1x, Molecular Grade (10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5-8,0) (Promega). O material foi mantido em
banho-Maria a 37°C por 5 min para completa eluição do sedimento.
O procedimento de hibridação consistiu na adição de 11 µL de 10X
Blocking Agent e 55 µL de Hi-RPM Hybridization Buffer. A reação foi
incubada a 95°C por 3 min e 37°C por 30 min. Um volume de 100 µL de
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