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Figura 3 - Representação gráfica dos iniciadores utilizados na qPCR para o mapeamento da deleção do gene ROBO1. A. Estão indicados os intros 3-4, exon 4 e intron 4-5 do ROBO1. O retângulo em laranja representa a perda genômica identificada no íntron 4-5 e o éxon mais próximo dessa alteração. B. Esquema das oito sondas mapeadas nessa região (S19 a S26) presentes na plataforma de aCGH. C. Esquema dos íntrons anterior e posterior ao éxon 4 e a localização dos seis pares de iniciadores construídos para o mapeamento da deleção identificada no íntron 4-5. P*_F e P*_R: par de iniciador forward e reverse, respectivamente; * representa o número do iniciador (1 ao 6); S: sonda. 45
O gene de referência, GAPDH, é frequentemente utilizado como gene de referência em análises de qPCR e neste estudo foi também selecionado por ter sido utilizado em estudo prévio de dosagem gênica em amostras obtidas a partir de sangue periférico (Reis et al. 2002). O gene HPRT foi selecionado por estar mapeado em Xq26.1. Dessa maneira, mulheres apresentam duas cópias do gene, enquanto homens apresentam uma única cópia. A eficiência da reação de amplificação para cada par de iniciadores foi determinada por meio de uma curva de diluição de um pool de DNA de amostras de sangue periférico em concentrações seriadas (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng e 0,01 ng). Para maior precisão, as reações em duplicata foram montadas no pipetador automático QIAgility (Qiagen, Courtaboeuf, France). Na reação foram utilizados 10 ng de DNA, 10 µM de cada iniciador e 5 µL de Power ® SYBR ® Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) num volume final de 12,0 µL. Foram utilizadas as seguintes condições de reação: desnaturação a 95°C por 10 min, seguido de 40 ciclos a 95°C por 15 seg e 60°C por 1 min no ABI Prism 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para a avaliação de todos os genes foram incluídos NTCs (no template control). Em todas as reações foram incluídos DNA obtidos a partir do sangue periférico de controles de mulheres e homens saudáveis, sem história pessoal e familial de câncer, os quais foram utilizados como normalizadoras da reação. 46
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A minha família!!!! DEDICATÓRIA
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Anexo 1 - Heredogramas
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Anexo 3 - Critérios de Bethesda pa
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