francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

pares de iniciadores específicos para cada fragmento amplificado. As
condições da reação de sequenciamento foram desnaturação a 95°C por 2
min, seguidos de 40 ciclos a 95°C por 18 seg, 50°C por 18 seg e 60°C por 3
min e 30 seg.
As amostras foram ressuspendidas em 13 μL de formamida Hi-Di
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), desnaturadas a 95°C em
termociclador por 3 min e imediatamente transferidas para recipiente com
gelo por 5 min. As reações de sequenciamento foram realizadas no
sequenciador ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA).
Análise dos dados de sequenciamento
As sequências foram analisadas no Software CLC Genomics
Workbench. Para a identificação das alterações, as sequências dos
pacientes foram alinhadas e comparadas com a sequência referência de
cada gene, a qual foi obtida no próprio software CLC Genomics Workbech.
Genes MLH1 e MSH2. As alterações identificadas foram comparadas
com os bancos de dados LOVD (Leiden Open Variation Database - A Colon
cancer gene variant database
http://chromium.liacs.nl/LOVD2/colon_cancer/home.php), MMR Gene
Unclassified Variants Database (http://www.mmrmissense.net), SIFT (Sorting
Intolerant from Tolerant - http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), POLYPHEN
(Polymorphism Phenotyping - http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) e Align
GVGD (http://agvgd.iarc.fr/agvgd_input.php) para a interpretação e
determinação do significado patogênico das alterações detectadas.
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