francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

particularmente envolvidos em câncer e outras sequências codificadoras e
não-codificadoras (http://www.chem.agilent.com), presentes no banco de
dados genômicos UCSC Hg18 (NCBI Build 36, March 2006).
A preparação da amostra do gDNA consistiu na avaliação da
concentração e qualidade utilizando o sistema Nanodrop ND-1000
Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) para
assegurar a ausência de proteínas e sais. Após a quantificação, as amostras
foram diluídas a uma concentração final de 100 ng/µL. A integridade do
gDNA foi avaliada em gel de agarose 0,8% com 500 ng de amostra. Como
referência, foi usado gDNA comercial normal (Promega, Mennheim,
Germany).
Os procedimentos de digestão, marcação e hibridação foram
realizados de acordo com as instruções recomendadas pelo fornecedor
(Agilent Technologies). As amostras foram submetidas a uma etapa de
digestão enzimática randômica em reação contendo 2,2 µL de água ultra-
pura estéril, 2,6 µL de tampão de reação 10X, 0,5 µL das enzimas Alu I e
Rsa I 10u/µL (Promega, Madison, WI). A reação foi incubada a 37°C por 2
horas, 65°C por 15 min e mantida em gelo durante o procedimento. O tempo
de digestão das amostras foi determinado após avaliação da integridade do
gDNA em gel de agarose.
Em seguida, os DNAs testes e referência foram marcados
diferencialmente com Cy3 TM -dUTP and Cy5 TM -dUTP, respectivamente, em
uma reação baseada no uso de iniciadores randômicos e na atividade da
enzima Exo-Klenow (Agilent Technologies). Essa reação foi realizada a 37°C
37