francine blumental de abreu - PHL © Elysio - FUNDAÇÃO ANTÔNIO ...

O gene de referência, GAPDH, é frequentemente utilizado como gene
de referência em análises de qPCR e neste estudo foi também selecionado
por ter sido utilizado em estudo prévio de dosagem gênica em amostras
obtidas a partir de sangue periférico (Reis et al. 2002). O gene HPRT foi
selecionado por estar mapeado em Xq26.1. Dessa maneira, mulheres
apresentam duas cópias do gene, enquanto homens apresentam uma única
cópia.
A eficiência da reação de amplificação para cada par de iniciadores foi
determinada por meio de uma curva de diluição de um pool de DNA de
amostras de sangue periférico em concentrações seriadas (100 ng, 10 ng, 1
ng, 0,1 ng e 0,01 ng). Para maior precisão, as reações em duplicata foram
montadas no pipetador automático QIAgility (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Na reação foram utilizados 10 ng de DNA, 10 µM de cada iniciador e 5 µL de
Power ® SYBR ® Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) num volume
final de 12,0 µL. Foram utilizadas as seguintes condições de reação:
desnaturação a 95°C por 10 min, seguido de 40 ciclos a 95°C por 15 seg e
60°C por 1 min no ABI Prism 7500 Real Time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para a avaliação de todos os genes
foram incluídos NTCs (no template control). Em todas as reações foram
incluídos DNA obtidos a partir do sangue periférico de controles de mulheres
e homens saudáveis, sem história pessoal e familial de câncer, os quais
foram utilizados como normalizadoras da reação.
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