LieÃ„ÂivÃƒÂ© rastliny v meniacich sa environmentÃƒÂ¡lnych podmienkach

More documents

Recommendations

Info

Vliv biotických a abiotických stresorů na vlastnosti rostlin 11.5.2005 Obr. 3: Shluky raných somatických embryí (SRSE); klon 2/32, po dvoutýdenní kultivaci in nature, fotografie z různého úhlu (Fotoaparát Olympus Digital Camera C-4040 ZOOM); 0° (a), 45° (b), 90° (c); Petriho miska se SRSE napasážovanými na kultivačním médiu (d). Studium kvantitativních vlastností rostlinných kultur in vitro může být prováděno různými analytickými nástroji. Nejčastěji se jedná o metodu vážení čerstvé hmotnosti kultury nebo počítání buněk /14/. V posledních letech se začala pro tato sledování používat počítačová analýza obrazu (IA). Ukazuje se, že by mohlo jít o vhodný nástroj pro pozorování růstu a morfologie prokaryotických i eukaryotických kultur /15/. Analýza obrazu je vhodným nástrojem pro sledování růstu buněčných kultur. Vzhledem ke své jednoduchosti a dobré reprodukovatelnosti je použitelná pro studium somatické embryogeneze u řady rostlinných druhů. Své uplatnění nalezla také v případě automatického sledování produkce somatických embryí /16/ případně tvaru, velikosti nebo barvy kultury. Metoda nachází uplatnění při studiu suspenzních kultur i kultur rostoucích na tuhých a polotuhých médiích /17/. Před použitím IA při experimentu je nutné nejdříve optimalizovat nastavení kamery a podmínky, za kterých experiment probíhá /18,19/. Pro stanovení viability bylo vyvinuto několik metod. Nejčastěji se provádí tzv. „dye exclusion test“ založený na selektivní permeabilitě cytoplazmatické membrány, například pro propidium jodid - PI). Jiné metody využívaní enzymové aktivity v živých buňkách (fluoresceindiacetát /FDA/ je štěpen esterázami na detekovatelný fluorescein a zbytky kyseliny octové). S rostoucí koncentrací iontů olova v médiu roste množství mrtvých buněk u jednotlivých raných somatických embryí. Dále je možné sledovat funkční metabolizmus buněk. Jednu z možností představují intracelulární esterázy. Esterázy katalyzují hydrolytické štěpení molekul jednoduchých esterů ob<strong>sa</strong>hujících krátké uhlíkaté řetězce /20/. V rostlinných buňkách a pletivech se účastní mnoha biochemických dějů, např. výstavby buněčné stěny /21/, degradace některých xenobiotik /22,23/ a signálních procesů /24/. Z výše uvedeného vyplývá, že esterasy představují značný potenciál pro rostlinné biotechnologie /25/. Díky své souvislosti s buněčným metabolizmem slouží esterázy jako ukazatel životaschopnosti (viability) /25/. Kromě toho některé práce upozornily na fakt, že je aktivita intracelulárních esteráz buněčné suspenze přímo úměrná počtu živých buněk /25/. Cílem práce bylo sledování vlivu těžkých kovů na kulturu raných somatických embryí smrku. Zaměřili jsme se především na vliv těžkých kovů na růst a životnost kultury. Dále jsme se snažili stanovit kadmium a olovo v biologickém vzorku. A proto je potřebné vyvíjet přesné analytické metody s nízkými limity detekce pro stanovení těžkých kovů v biologických, environmentálních i potravinářských vzorcích /26-30/. Nejběžněji využívané techniky pro stanovení těžkých kovů jsou atomová absorpční spektrometrie s atomizací v plamenu a nebo v grafitové kyvetě. Pro velmi přesné stanovení se používá atomová absorpční spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem /31-35/. Mezi vysoce senzitivní techniky také patří elektroanalytické postupy s detekčními limity v nM a pM koncentracích. Diferenční pulzní voltametrie v kombinaci s anodickým rozpouštěním patří mezi nejcitlivější elektroanalytické metody využívané pro detekci těžkých kovů /30,36/. Stanovení těžkých kovů bylo provedeno právě pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV). Kromě těžkých kovů lze u rostlin stanovit také thiolové sloučeniny, jako jsou glutathion a fytochelatiny /36-39/, jejichž syntézou se rostliny intenzivně brání proti působení těžkých kovů. Materiál a metodika Rostlinný materiál Byly využity kultury raných somatických embryí smrku ztepilého (Picea abies /L./ Karst.), klony 2/32 a 3/5 H, a smrku pichlavého (Picea pungens Engelm.), klon PE 14. Klony 2/32 a 3/5 H pochází ze smrku ztepilého horského klimaxového typu z pokusné plochy v Beskydách. Klon PE 14 byl odvozen ze smrku pichlavého, byla použita zralá semena ze vzrostlého stromu Picea pungens Engelm. ’Argentea’ v areálu Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Embrya byla kultivována ve sterilních plastových Petriho miskách (průměr 90 mm, 30 ml LP/2 média). Na jednu misku připadlo vždy 10 SRSE. SRSE byla po 14 dnech pasážována za striktně sterilních podmínek (flow box Galaire HF 36). Při pasáži byly z horních partií SRSE odebírány části s vyvinutými skupinami embryonálních buněk o hmotnosti přibližně 2,5 – 5,0 mg a přenášeny na novou Petriho misku s LP/2 médiem. SRSE byly kultivovány ve tmě při teplotě 23±2 °C. 221
Vliv biotických a abiotických stresorů na vlastnosti rostlin 11.5.2005 Kultivační médium Všechny výše uvedené kultury byly dlouhodobě kultivovány na kultivačním médiu LP/2 /1/, které bylo modifikováno 9 μM 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinou a 4,4 μM benzylaminopurinem /10/. Anorganické i organické složky média byly rozpuštěny v deionizované destilované vodě, pH bylo upraveno na hodnotu 5,7 – 5,8 pomocí KOH/HCl (pH metr Schott CG 842). Následně byla anorganická část média sterilizována při teplotě 121°C a tlaku 100 kPa po dobu 30 minut (Tuttnauer 3870 EA); organická část byla sterilizována membránovou filtrací (Whatman Puradisc 25 AS 0,2 µm). Při pokusech byly využity modifikace média. Do základního média byl přidán chelát olova (Pb- EDTA) a chelát kadmia (Cd-EDTA) v koncentracích 50 μM, 250 μM a 500 μM. Roztok Pb-EDTA byl připraven podle /40/. Zásobní roztok Pb(NO 3 ) 2 (Cd(NO 3 ) 2 .4H 2 O) byl smíchán s kyselinou etylendiamintetraoctovou (EDTA) v poměru 1:1 při teplotě 50°C po dobu 1 h. Complex Pb-EDTA (Cd- EDTA) byl přidán k anorganické části kultivačního média. Vážení SRSE Růst SRSE byl zjištěn vážením, které bylo prováděno ve flow-boxu (Galaire HF 36) na analytických vahách (Denver Instrument APX-153). SRSE byly velmi opatrně očištěny od média pomocí fosfátového pufru (pH 7.0). Analýza obrazu SRSE Pro zjištění plochy SRSE byla nutná digitalizace obrazu každé Petriho misky. Digitalizace byla prováděna pomocí kamery CCD Sony (UPV-GDS 8 000) a programu GRAB-IT. Pro vyhodnocení jednotlivých ploch byl využit program IMAGE – PRO ® . Plochy byly zjišťovány na začátku a poté v průběhu experimentu. Údaje byly dále zpracovány v programu Microsoft Excel; výsledkem byl průměrný přírůstek SRSE. Stanovení životnosti pomocí fluorescenčních barviv Současně s růstem SRSE byla sledována životnost embryí. Pro vlastní sledování životnosti buněk bylo využito barvení buněčné suspenze fluorescenčními barvivy – propidium jodidem (PI) a fluoresceindiacetátem (FDA) podle metody /41/. PI není propouštěn přes cytoplazmatickou membránu dovnitř živé buňky. V případě mrtvé buňky, která má nefunkční cytoplazmatickou mebránu, se dostává dovnitř a způsobuje červené fluorescenční zbarvení. FDA je v živých buňkách štěpen na octan a fluorescein, který vydává zelené fluorescenční zbarvení. Při vlastním barvení byla odebrána horní část SRSE, která byla umístěna na podložní sklíčko a následně byla zakápnuta suspenzí (37 μl destilované, 10 μl PI a 3 μl FDA) /42/. Po pěti minutách inkubace se připravený preparát pozoroval pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu Olympus AX 70 při zvětšení 4 x 10 a 10 x 10. Pro pozorování bylo využito filtru WU, excitace při vlnové délce 330 – 385 nm. Při sledování preparátů byla pořízena jejich fotodokumentace digitálním fotoaparátem Olympus Camedia C-4040 ZOOM. Životnost byla vypočítána pomocí analýzy obrazu; program IMAGE – PRO ® vypočítal zastoupení červeně a zeleně zbarvených buněk, tedy buněk mrtvých a živých. Stanovení životnosti pomocí aktivity intracelulárních esteráz SRSE byly odebrány z pevného media, následně byly promyty 50 mM fosfátovým pufrem (pH 8,7) a byly uchovávány při teplotě –20 °C. Po rozmrazení byly vzorky doplněny na celkový objem 1 ml extrakčním pufrem (250 mM fosfátový pufr, pH 8,7; 100 μM DTT) a desintegrovány ve skleněném pístovém homogenizátoru (Kavalier, Česká republika), uloženém v ledové lázni po dobu 10 min. Získané rostlinné homogenáty byly umístěny v ledu do ultrazvukové lázně po dobu 1 min. a poté byly centrifugovány (10 000 g, 15 min, 4 °C). Alikvot supernatantu byl přidán do reakční směsi ob<strong>sa</strong>hující fosfátový pufr (1 mM, pH 8,7) a 5 μM FDA, jehož zásobní roztok v bezvodém acetonu byl uchováván v uzavřených nádobkách při –20 °C. Množství acetonu v reakční směsi nepřekročilo 1 % (v/v). Po 15 minutové inkubaci v termostatu při 55 °C byla změřena fluorescence (RF-551, Shimadzu Scientific Instruments Inc., USA) – excitace 490 nm / emise 514 nm. Aktivita esteráz v IU (jedna mezinárodní jednotka uvolní při výše uvedených podmínkách 1 μmol fluoresceinu za minutu) byla přepočítána na relativní hodnoty, kdy 100 % představuje nejvyšší naměřenou aktivitu v daném experimentu. 222
Page 4 and 5:
Vliv abiotických a biotických str
Page 6 and 7:
Page 8 and 9:
Page 10 and 11:
Page 12 and 13:
Page 14 and 15:
Page 16 and 17:
Page 18 and 19:
Page 20 and 21:
Page 22 and 23:
Page 24 and 25:
Page 26 and 27:
Page 28 and 29:
Page 30 and 31:
Page 32 and 33:
Page 34 and 35:
Page 36 and 37:
Page 38 and 39:
Page 40 and 41:
Page 42 and 43:
Page 44 and 45:
Page 46 and 47:
Page 48 and 49:
Page 50 and 51:
Page 52 and 53:
Page 54 and 55:
Page 56 and 57:
Page 58 and 59:
Page 60 and 61:
Page 62 and 63:
Page 64 and 65:
Page 66 and 67:
Page 68 and 69:
Page 70 and 71:
150 Vliv abiotických a biotických
Page 72 and 73:
Page 74 and 75:
Page 76 and 77:
Page 78 and 79:
Page 80 and 81:
Page 82 and 83:
Page 84 and 85:
Page 86 and 87:
Page 88 and 89:
Page 90 and 91:
Page 92 and 93:
Page 94 and 95:
Page 96 and 97:
Page 98 and 99:
Page 100 and 101:
Page 102 and 103:
Page 104 and 105:
Page 106 and 107:
Page 108 and 109:
Page 110 and 111:
Page 112 and 113:
Page 114 and 115:
Page 116 and 117:
Page 118 and 119:
Page 120 and 121:
Page 122 and 123:
Page 124 and 125:
Page 126 and 127:
Page 128 and 129:
Page 130 and 131:
Page 132 and 133:
Page 134 and 135:
Page 136 and 137:
Page 138 and 139:
Page 140 and 141:
Page 142 and 143:
Page 144 and 145:
Page 146 and 147:
Page 148 and 149:
Page 150 and 151:
Page 152 and 153:
Page 154 and 155:
Page 156 and 157:
Page 158 and 159:
Page 160 and 161:
Page 162 and 163:
Page 164 and 165:
Page 166 and 167:
Page 168 and 169:
Page 170 and 171: Vliv abiotických a biotických str
Page 180 and 181: 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4
Page 186 and 187: Vliv biotických a abiotických str
Page 270 and 271:
Vliv biotických a abiotických str
Page 272 and 273:
Page 274 and 275:
Page 276 and 277:
Page 278 and 279:
Page 280 and 281:
Page 282 and 283:
Page 284 and 285:
Page 286 and 287:
Page 288 and 289:
Page 290 and 291:
Page 292 and 293:
Page 294 and 295:
Page 296 and 297:
Page 298 and 299:
Page 300 and 301:
Page 302 and 303:
Page 304 and 305:
Page 306 and 307:
Page 308 and 309:
Page 310 and 311:
Page 312 and 313:
Page 314 and 315:
Page 316 and 317:
Page 318 and 319:
Page 320 and 321:
Page 322 and 323:
Page 324 and 325:
Page 326 and 327:
Page 328 and 329:
Page 330 and 331:
Page 332 and 333:
Page 334 and 335:
Page 336 and 337:
Page 338 and 339:
Page 340 and 341:
Page 342 and 343:
Page 344 and 345:
Page 346 and 347:
Page 348 and 349:
Page 350 and 351:
Page 352 and 353:
Page 354 and 355:
Page 356 and 357:
Page 358 and 359:
Page 360 and 361:
Page 362 and 363:
Page 364 and 365:
Page 366 and 367:
Page 368 and 369:
Page 370 and 371:
Page 372 and 373:
Page 374 and 375:
Page 376 and 377:
Page 378 and 379:
Page 380 and 381:
Page 382:
show all

LieÃ„ÂivÃƒÂ© rastliny v meniacich sa environmentÃƒÂ¡lnych podmienkach

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

LieÃ„ÂivÃƒÂ© rastliny v meniacich sa environmentÃƒÂ¡lnych podmienkach