Liečivé rastliny v meniacich sa environmentálnych podmienkach

Vliv biotických a abiotických stresorů na vlastnosti rostlin
11.5.2005
Materiál a metodika
Rostlinný materiál a inokulace
Pro studium vlivu exogenní aplikace cytokininů na průběh infekce biotrofní houbou B.
lactucae byl zvolen genotyp salátu L. sativa (Cobham Green) vykazující
náchylnost/kompatibilitu k použité rase B. lactucae Regel (NL 16). Semenáčky byly
předpěstovány v perlitu a přesazeny do květníků se zahradním substrátem. Rostliny byly
pěstovány ve fytotronu v režimu 12 h světlo/12 h tma při teplotě 18°C/15°C. Ve stáří 10
týdnů byly z rostlin odděleny listové disky o průměru 12 mm (ze třetího až šestého
nejmladšího listu). Disky byly umístěny adaxiální stranou dolů do Petriho misek s buničinou a
filtračním papírem nasycenými jednotlivými roztoky (viz dále). Po 24 hodinách infiltrace
roztoků do listových disků při sníženém tlaku byla polovina vzorků z každé varianty
inokulována, polovina sloužila jako kontrola. Inokulum (suspenze konidií v destilované vodě
o hustotě cca 5·10 4 -10 5 konidií na cm 3 ) bylo rozptýleno na abaxiální stranu listových disků.
Vzorky byly inkubovány ve fytotronu při teplotě 15°C/10°C, prvních 24 hodin ve tmě a
následně v režimu 12 h světlo/12 h tma. Měření bylo provedeno u kontrolních (neoddělených)
listů salátu v den oddělování listových disků (kontrola) a na listových discích po 11 dnech po
inokulaci (tj. po 12 dnech po aplikaci příslušných roztoků).
Roztoky cytokininů
V experimentech byly použity dvě formy aromatických cytokininů: 2·10 -4 M metatopolin
(volná báze) /7/ v 0,5% dimethylsulfoxidu (DMSO) a 2·10 -4 M 3-MeOBAPR (ribozid)
/8/ v 0,25% DMSO. Jako referenční roztoky byly použity: destilovaná voda (H 2 O) a 0,5%
DMSO (vyšší koncentrace roztoku užívaného k rozpuštění cytokininů).
Stanovení míry sporulace a výnosu spor
Na listových discích v různých variantách pokusu byl stupeň napadení hodnocen
v průběhu 11 dní po inokulaci na základě makroskopického stanovení sporulace patogenu,
kde souhrnná hodnota vyjadřuje procento maximální možné sporulace /9/. Výnos spor byl
stanoven 14. den po inokulaci omytím disků v destilované vodě a počítáním hustoty sporové
suspenze v Bürkerově komůrce. V každé variantě bylo provedeno 5 měření ve třech
opakováních. Data byla statisticky vyhodnocena hierarchickou ANOVOU a Bonferoniho
testem mnohonásobných porovnání v programu NCSS 2000.
Obsah fotosyntetických pigmentů
Listové disky byly zhomogenizovány v 80% acetonu s malým množstvím MgCO 3 ,
homogenát byl zcentrifugován (5 min, 3600g, pokojová teplota) a následně byla stanovena
absorbance supernatantu při vlnových délkách 470; 646,8; 663,2 a 750 nm oproti 80%
acetonu (spektrofotometr UV6-550 Unicam, Cambridge, Anglie). Obsah chlorofylů a
karotenoidů byl vypočítán podle Lichtenthalera /10/.
Měření maximální fotochemické účinnosti fotosystému II
Na kontrolních (neoddělených) listech salátu a na listových discích byla změřena
maximální fotochemická účinnost fotosystému II (parametr F V /F P ) pomocí fluorimetru PEA
(Hansatech, King’s Lynn, Anglie). Před měřením byly vzorky 30 minut zatemněny.
Fluorescenční signál byl snímán z adaxiální strany listů (disků), doba detekce byla 2 s,
intenzita excitačního záření 6000 μmol fotonů m -2 .s -1 .
Stanovení míry peroxidace lipidů
Listové disky byly homogenizovány ve 4 cm 3 0,1% kyseliny trichloroctové (TCA). Poté
byl homogenát zcentrifugován (10 min, 10000g, 4°C) a k 1 cm 3 supernatantu byly přidány 4
cm 3 20% TCA obsahující 0,5% kyselinu thiobarbiturovou (TBA). Tato směs byla 30 min
vařena na vodní lázni, poté rychle schlazena na ledové tříšti a zcentrifugována (10 min,
10000g, 4°C). U supernatantu byla změřena absorbance při vlnových délkách 532 a 600 nm
(spektrofotometr CHEM 2000, Ocean Optics, Dunedin, USA). Jako referenční vzorek byl
303