Liečivé rastliny v meniacich sa environmentálnych podmienkach

Vliv biotických a abiotických stresorů na vlastnosti rostlin 11.5.2005
Materiál a metodika
Pro studium lokalizace AOS a stanovení aktivit antioxidačních enzymů, byl vybrán soubor
šesti genotypů Lactuca spp.: L. sativa (UCDM2, Mariska), L. serriola (LSE/18, PIVT 1309), L.
saligna (CGN 05271) a L. virosa (NVRS 10.001 602) s různým fenotypem exprese
náchylnosti/rezistence vůči zvolené rase Bremia lactucae Regel. Rostliny byly pěstovány ve
fytotronu při fotoperiodě 12h a teplotě 18/15°C. Ve vývojovém stádiu cca 8 týdnů byly inokulovány
suspenzí spor B. lactucae (rasa NL 16) a ve tmě kultivovány při teplotě 12/15°C /8/. Kontrolní
neinokulované rostliny byly pěstovány za stejných podmínek. V intervalech 6, 12, 18, 24, 36, 48,
96 hodin po inokulaci (hai) byly odebírány listy a 1/ okamžitě podrobeny histochemickým
metodám; 2/ zamraženy v tekutém dusíku a skladovány v -80°C pro biochemické testy.
Histochemické metody
Lokalizace produkce peroxidu vodíku in situ byla stanovena reakcí H 2 O 2 s diaminobenzidinem
(DAB) za vzniku tmavě hnědé sraženiny. POX byla detekována inkubací v roztoku DAB
s přídavkem H 2 O 2 . Tvorba superoxidového anionu (O 2 - ) in situ byla detekována na základě
produkce nerozpustného modrofialového formazanu po interakci s NBT. Infiltrace barviv do
rostlinného pletiva byla provedena ve vakuu po dobu 5h. Povařením v ethanolu byl extrahován
chlorofyl a zastaveny enzymové reakce. Použité metody jsou podrobně popsány v práci Mlíčková et
al. /9/.
Biochemické metody
Aktivity enzymů (guajakol-POX, CAT, SOD), obsah peroxidu vodíku a změny v zastoupení
izoenzymů POX a SOD, byly studovány v extraktech listů kontrolních a infikovaných rostlin ve
třech opakováních za použití tří nezávislých souborů rostlin. Extrakty pro stanovení enzymových
aktivit byly připraveny v 0,05 M fosfátovém pufru (pH 7,0) s 1% polyvinylpolypyrrolidonem, pro
izolaci peroxidasy byly zařazeny další dva kroky: 1/ 1% Tritonem byl extrahován membránově
vázaný enzym a 2/ 0,1M KCl enzym iontově vázaný /10/. Spektrofotometrické metody byly použity
pro detekci guajakol-POX /11/, CAT /11/, SOD /12/ a pro kvantifikaci peroxidu vodíku /13/.
Koncentrace proteinu byla stanovena Lowryho metodou /14/. Pro stanovení isoenzymového spektra
POX a SOD bylo použita metoda nativní elektroforézy v PAGE /15/.
Výsledky a diskuse
Studium produkce AOS a změn aktivit antioxidačních enzymů provázejících patogenezi B.
lactucae navázalo na předchozí studium základních rozdílů v rychlosti a kvalitě odezvy buněk
různých genotypů Lactuca spp. na infekci daným patogenem /8,16/. Kombinací biochemických a
histochemických metod byly zjištěny skutečnosti, které lze shrnout v následujících bodech:
1/ Relativně nízké hodnoty hladiny peroxidu vodíku i aktivit antioxidačních enzymů
v listových pletivech Lactuca spp. ve srovnání s jinými patosystémy /7,9,11/;
2/ Nebyla prokázána přítomnost superoxidu, aktivita SOD byla nízká u náchylných i
rezistentních genotypů, nedocházelo ke změnám aktivity po napadení B. lactucae;
3/ Velmi široké je spektrum biochemických změn u genotypů s různým průběhem
cytologické/histologické reakce k danému izolátu patogenu;
4/ V pletivech Lactuca spp. má hlavní podíl cytosolická POX, aktivita iontově a membránově
vázaných POX je zanedbatelná;
5/ V aktivitě POX dochází k výrazným změnám v počátečních fázích infekce (6-12 hai),
především pak u rezistentního genotypu L. virosa (NVRS 10.001 602), po 18 hai se na rozkladu
peroxidu vodíku účastní intenzivněji CAT;
6/ Zvýšená koncentrace H 2 O 2 detekovaná po 24 hai u rezistentního genotypu L. virosa
(NVRS 10.001 602) se podílí na indukci a průběhu HR (viz obr. 1);
7/ U L. saligna (CGN 05172) dochází k nárůstu peroxidu vodíku 24 hai, aktivita CAT byla
lehce zvýšena 6-18 hai, POX začíná narůstat po 24 hai, což koresponduje s předpokladem jiné než
rasově specifické rezistence u tohoto genotypu, ale i jeho fenotypovým projevem (vývoj patogenu a
exprese HR jsou zpožděny) (viz obr. 2);
275