UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID - Biblioteca de la ...

4.2.1. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS
Material y Métodos
La extracción de la grasa química se realiza mediante la técnica de
Hanson y Olley (1963), siendo una modificación de la técnica de Bligh y Dyer
(1959).
El principio de esta técnica consiste en tratar el producto con una
mezcla de dos solventes, cloroformo y metanol, donde el metanol rompe los
enlaces lipido-proteícos y el cloroformo solubiliza los lípidos. Para la
eliminación de las sustancias no lipídicas solubles en la mezcla, el extracto es
lavado con agua salina. La sal disminuye la disociación de los ácidos lipídicos y
de esta forma no se disocia la fase solvente (cloroformo). Además, la presencia
del agua salina, unida al metanol, permite separar la fase clorofórmica (fase
inferior) de la fase metanólica (fase superior).
Para el desarrollo de la metodología se toman 20 g de grasa ó 25 de
músculo, limpios y picados, y se introducen en tubos de centrífuga de 250 ml
de capacidad. A la muestra se le añade una punta de espátula de BHT (butil
hibroxil tolueno, para prevenir la oxidación lipídica), 40 ml de metanol y 20 ml
de cloroformo, así como la cantidad de agua salina necesaria hasta completar
un total de 16 ml, siendo la relación cloroformo/metanol/agua 1/2/0.8 (v/v/v).
Después se homogeneiza la muestra durante 20 minutos, sumergiendo el tubo
en un baño de hielo para evitar el calentamiento de la muestra. Realizando este
tratamiento la solución debe ser monofásica.
Posteriormente se añaden otros 20 ml de cloroformo y 20 ml de agua
destilada salina, siendo la relación cloroformo/metanol/agua de 2/2/1.8 (v/v/v).
Se vuelve a homogeneizar la muestra durante medio minuto en baño de hielo.
A continuación, se centrifugan los tubos a 2000 r.p.m. durante 30 segundos y a
0ºC. Al centrifugar se forman tres fases: la fase superior es agua y metanol, la
fase intermedia contiene sedimentos sólidos, y la inferior es la grasa disuelta en
cloroformo. Se debe, por tanto eliminar la fase superior y atravesando la
intermedia, recoger con una pipeta una alícuota de 20 ml de la fase inferior.
La alícuota se filtra en un matraz redondo de fondo plano de 25 ml,
mediante un papel Whatman nº 42, cubierto con una punta de espátula de
sulfato sódico anhidro (usado para permitir condiciones anhídridas), lavando
posteriormente dicho filtro con una mezcla de cloroformo/metanol en proporción
2/1 (v/v) y 0.05% de BTH.
La grasa se concentra eliminando los disolventes en un evaporador
rotatorio, con el baño de agua a 35-40ºC, cubriendo la parte inferior del matraz.
Para asegurar la total evaporación de los solventes se llevan los matraces a
otro baño de agua a 35-40ºC, donde se les infunde una corriente de nitrógeno.
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