Periodoncia.Eley.6a.Ed

184 Periodoncia
(fig. 14.2B). En el análisis ELISA (fig. 14.2C), el anticuerpo primario es detectado
a través de una reacción colorimétrica catalizada por una enzima, la peroxidasa
del rábano o la fosfatasa alcalina, unida al anticuerpo. Esas técnicas son
muy específicas si se utilizan controles para detectar las reacciones inespecíficas.
Sólo permiten detectar especies para las que se disponga de un anticuerpo.
Sondas de ADN
Las sondas de ADN han sido desarrolladas para identificar secuencias de
nucleótidos específicas para bacterias consideradas de relevancia diagnóstica
(Highfield y Dougan, 1985), entre ellas los patógenos periodontales de
sospecha (French et al., 1986; Savitt et al., 1988; Loesche, 1992). Esas sondas
pueden detectar cantidades tan pequeñas como 103 células en una mezcla,
y proporcionan información sobre la presencia de especies seleccionadas
en la muestra. Sin embargo, no pueden proporcionar datos cuantitativos fiables
y están limitadas por la disponibilidad de sondas. Son por completo
específicas y quizá no detecten especies presentes en gran número en la
muestra si no se buscan específicamente.
Un método comercial basado en la RCP para la detección de especies
periodontopatógenas en muestras de placa subgingival (prueba MicroDent ® )
ha demostrado ser más rápido, más fácil de usar y mucho más sensible que
los métodos de cultivo. Emplea sondas para Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, B. forsythus, A. actinomycetemcomitans y T. denticola
(Eick y Pfister, 2002).
Análisis basados en enzimas
Análisis BANA
Otro método para la detección de determinadas especies bacterianas consiste en
buscar una enzima exclusiva para una o varias de las especies bacterianas en
cuestión. La muestra de placa es expuesta a un sustrato que sólo puede ser hidrolizado
por una enzima específica. Un ejemplo de este método es la detección de
una proteasa similar a la tripsina producida principalmente por Porphyromonas
gingivalis y en mucha menor cuantía por B. forsythus y T. denticola. La proteasa
rompe el sustrato BANA (benzil arginina naftilamida) (Loesche 1986, 1992;
Loesche et al., 1990). Puesto que algunas de esas especies crecen poco en los
cultivos y representan una proporción significativa de la actividad proteasa de la
flora subgingival, esos análisis enzimáticos proporcionan un método rápido y
barato para detectar estas bacterias en las muestras.
Los inconvenientes principales son la falta de datos cuantitativos y la imposibilidad
de aclarar cuáles de las tres bacterias son responsables de la producción
de enzima. En la mayoría de los casos, sin embargo, será P. gingivalis
puesto que produce mucha más cantidad de proteasa que las otras dos bacterias
combinadas (Gazi et al 1994, 1996). Además, el sistema BANA no incluye inhibidores
de las proteinasas del huésped que podrían cortar el sustrato y que también
podrían contaminar la muestra bacteriana bajo prueba (Cox y Eley, 1989).
Polarización fluorescente cuantitativa
Las moléculas marcadas con una señal fluorescente emiten luz fluorescente en
el mismo plano de polarización cuando son excitadas por luz polarizada, siempre
que la molécula permanezca estacionaria en el estado de excitación. Se han
desarrollado instrumentos (analizador FPM-1TM FP, Jolley Consulting and
Research Inc., Grayslake, IL) para medir ese fenómeno en tiempo real (Schade
et al 1996; Jolley, 1996). Las proteínas marcadas tienen masa suficiente para
rotar sólo ligeramente y la luz emitida, que es medida, permanece polarizada.
Después de la adición de enzimas proteolíticas el valor de milipolarización (mP)
desciende con el tiempo, puesto que las moléculas pequeñas marcadas resultantes
de la degradación producen movimiento cinético suficiente para despolarizar
la luz y reducir así el valor mP. Una fracción fluorescente, el éster succinimidilo
del ácido 4, 4’ difluoro-5, 7-dimetil-4-boro-3a, 4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico
(BODIPY FL C3-SE, Molecular Probes-Inc.; BODIPY ® ) ha sido unido a
un sustrato proteínico, la caseína bovina, para producir un sustrato fluorescente
adecuado con ese fin (Schade et al., 1996; Jolley, 1996) y se ha demostrado que
esos análisis se pueden realizar en presencia de la bacteria completa.
El método se ha usado para detectar la proteína extracelular de Mycobacterium
bovis (Lin et al., 1996) y puede ser adaptado para la medición
cuantitativa de proteínas o proteasas de bacterias de la placa.
Compuestos sulfurosos volátiles
Los compuestos sulfurosos volátiles, como el sulfuro de hidrógeno, H 2
S,
metil mercaptano, CH 3
SH, dimetil sulfuro (CH 3
) 2
S y dimetil disulfuro
(CH 3
) 2
S 2
son todos ellos productos tóxicos originados del metabolismo que
realizan las bacterias anaerobias gramnegativas de los aminoácidos que contienen
azufre (v. cap. 5). Se ha demostrado que P. gingivalis, Prevotella intermedia,
P. melaninogenica, B. forsythus, T. denticola y F. nucleatum pueden
producirlos a través de sus vías metabólicas (Persson et al., 1989, 1990c).
Un instrumento desarrollado recientemente y disponible en el mercado, el
Diamond Probe/Perio 2000 System ® (Diamond General Development
Corporation, Ann Arbor, EE.UU.) ha sido diseñado para combinar las características
de una sonda periodontal con la detección de compuestos sulfurosos
volátiles en la bolsa periodontal.
Se ha demostrado que los niveles de compuestos sulfurosos volátiles en la
bolsa periodontal son más altos en los pacientes con periodontitis crónica
que en los controles sanos (Yaegaki y Sanda, 1992a, b). Otros varios estudios
han indicado también que la concentración de sulfuro es mayor en las bolsas
más profundas que en las superficiales, y que disminuye cuando las bolsas
son reducidas quirúrgicamente (Horowitz y Folke 1972; Yaegaki y Sanda
1992a, b). También se ha demostrado que las lecturas de azufre de la sonda
guardan relación con los parámetros clínicos de gravedad de la enfermedad
(Polychronopoulou, 1998). Sin embargo, la relevancia clínica de esos resultados
se vio disminuida por la pobre sensibilidad de la sonda en los límites
superior e inferior de su escala. Eso hizo que la mayoría de las lecturas de
sitios aparentemente sanos o enfermos fuesen de cero. Sería necesario mejorar
la sensibilidad para que el instrumento resultase útil en su uso clínico.
Además, no existen estudios longitudinales sobre la relación entre compuestos
sulfurosos volátiles y la progresión de la enfermedad periodontal, y por
tanto se desconoce el potencial diagnóstico.
Proteasas bacterianas en la saliva y el líquido crevicular
Saliva
Para detectar enzimas bacterianas en la saliva se necesitan muestras de
saliva completa no estimulada. Se ha demostrado que las concentraciones
de proteasa similar a la tripsina en la saliva guardan relación con los
índices clínicos de gravedad de la enfermedad, y que disminuyen después
del tratamiento periodontal (Zambon et al., 1985a; Nieminen et al., 1993).
Sin embargo, se ha demostrado (Ingman et al., 1993) que esas enzimas no
tienen todas las propiedades bioquímicas de la proteasa similar a la tripsina
de P. gingivalis (gingipaína). Las enzimas detectadas en la saliva pueden
proceder del huésped o representar una mezcla de enzimas del huésped y
bacterianas.
Líquido crevicular
Las proteasas bacterianas son liberadas en la bolsa y pueden ser detectadas
en el líquido crevicular (Cox et al., 1989a). Se han desarrollado análisis bioquímicos
selectivos para la dipeptidilpeptidasa (DPP) bacteriana y las proteasas
similares a la tripsina, que pueden diferenciarlas de las proteasas
derivadas de los tejidos (Eley y Cox, 1994; Gazi et al., 1995). La proteasa del
tipo tripsina detectada por este análisis es una cisteína proteinasa y tiene las
características de la enzima llamada ahora arg-gingipaína o arg-gingivaína
(v. cap. 5). Esas enzimas guardan relación positiva con los índices clínicos de
gravedad de la enfermedad y disminuyen de modo significativo después del
tratamiento periodontal (Eley y Cox, 1995a).
Recientemente se ha completado un estudio longitudinal de 2 años sobre
la DPP bacteriana en el líquido crevicular y la arg-gingivaína/arg-gingipaína
en 75 pacientes (Eley y Cox, 1996a). El estudio empleó los umbrales