Periodoncia.Eley.6a.Ed

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(Aduse-Opoko et al., 1999; Curtis et al., 1999; Mortensen y Kilian, 1984). El
segundo gen era muy similar a rgpA, pero carecía de su extensión C-terminal
(Mikolajczyk-Pawlinska et al., 1998; Nakayama, 1997; Rangarajan et al.,
1997b; Slakeski et al., 1998). Es posible que este segundo gen surgiera por
un proceso de duplicación del gen. Este segundo gen específico de arginina
se ha denominado rgpB (Curtis et al., 1999).
La primera secuencia completa del gen de la proteinasa específica de
lisina se determinó a partir de la cepa W12 y se llamó prpP (Barkocy-
Gallagher et al., 1999). Esto se siguió de otras cinco secuencias con productos
específicos de lisina, que se incluyeron en la base de datos (Curtis et al.,
1999). Estas secuencias eran kgp de las cepas HG66 y 381, kgp(381)-hagD
de 381, prpP de W80 y prtK de W50 (Lewis y Macrina, 1998; Okamoto et
al., 1996; Pavloff et al., 1997; Slakeski et al., 1999). En cada caso se observó
que la organización genómica de estos locus era muy similar al gen de la
proteinasa específica de arginina/hemaglutinina, rgpA.
La comparación entre los genes específicos de lisina reveló que todos eran
muy homogéneos, especialmente en los dominios proproteína y catalítico.
Sin embargo, la extensión C-terminal tenía algunos reordenamientos entre
las cepas (Curtis et al., 1999). Los experimentos de hibridación, mediante la
técnica Southern blot, han confirmado que el dominio catalítico sólo se
encuentra como una copia en el cromosoma de P. gingivalis (Barkocy-
Gallagher et al., 1999; Lewis y Macrina 1998). Por tanto, se ha concluido que
los genes kgp, prtK y prtP tienen locus homólogos en diferentes cepas, y que
podrían redefinirse con un único descriptor, kgp.
El kgp purificado de las cepas HG66 y 33277 (Otsuka et al., 1987) y el
prtK de la cepa W50 parecen ser específicos de los enlaces de lisina, aunque
se ha encontrado el prtK, asociado a células, en unión no covalente con el
prpR, una proteinasa específica de arginina (Slakeski et al., 1998). Por el
contrario, se ha sugerido que la proteinasa del gen prtP de la cepa W12 tiene
doble actividad específica para los enlaces de arginina y de lisina (Ciborwski
et al., 1994). Sin embargo, esta controversia se ha resuelto con los experimentos
de inactivación de genes (Nakayama, 1997; Nakayama et al., 1995).
En primer lugar, la inactivación de los dos genes específicos de arginina
suprime toda la actividad proteinasa de arginina en las cepas 33277
(Nakayama et al., 1995) y W50 (Nakayama, 1997), lo que indica que estos
genes son responsables de toda esta actividad. En segundo lugar, se ha
observado que la proteinasa prtP de especies de Bacteroides sólo tiene actividad
lisil (Barkocy-Gallagher et al., 1999). Tercero, la inactivación del gen
prtP en la cepa W12 (Barkocy-Gallagher et al., 1999), el gen kgp en la cepa
ATCC 33277 (Okamoto et al., 1998) y el gen prtK en la cepa W50 (25) no
tuvo efecto sobre la actividad proteinasa de arginina, mientras que la actividad
proteinasa de lisina se redujo hasta alcanzar los niveles basales. Así
pues, parece que la actividad de la proteinasa de lisina deriva de un único
producto génico completamente específico de los enlaces lisil peptídicos
(Curtis et al., 1999).
La nomenclatura propuesta (Curtis et al., 1999) es rgpA (arg-gingipaína A)
y rgpB (arg-gingipaína B) para los dos genes específicos de arginina, y kgp
(lis-gingipaína) para el gen específico de lisina.
La organización de los genes se muestra en la figura 5.3 (Curtis et al.,
1999). Puede verse que, mientras los genes rgpA y kgp contienen dominios
propéptido, catalítico y de hemaglutinina/adhesina, rgpB sólo contiene dominios
propéptido y catalítico.
Estos genes dan lugar a un proceso complejo de traducción que lleva a la
producción de múltiples isoformas de proteinasa (Curtis et al., 1999; Chen et
al., 1992; Pike et al., 1994; Rangarajan et al., 1997b; Slakeski et al., 1998),
que son (fig. 5.3):
Formas heteroméricas o multiméricas de RgpA formadas por la cadena
catalítica en unión no covalente con adhesina y, ocasionalmente,
formando un complejo con Kgp, que se ha denominado HRgpA.
Formas monoméricas solubles de las cadenas catalíticas de Rgp o Kgp
(∼50 kDa). Éstas se han denominado RgpA(cat) y RgpB(cat).
Formas de estos monómeros asociadas a la membrana que contienen
grandes adiciones posteriores a la traducción (∼70-80 kDa), conocidas
como mtRgpA(cat) y mtRgpB(cat).
El gen kgp también puede dar lugar a productos similares, pero éstos aún
no han sido totalmente determinados (Curtis et al., 1999).
Las poliproteínas, RgpA y Kgp se procesan proteolíticamente y se transforman
en proteinasas y adhesinas. Veith et al. (2004) han demostrado, utilizando
espectrometría de masas tipo trampa de iones, que las proteinasas y
adhesinas RgpA y Kgp son procesadas a nivel C-terminal por la carboxipeptidasa
CPG70 mediante la secuenciación de los péptidos C-terminales de
ambos tipos, nativo y un mutante CPG70 isogénico.
En un estudio experimental de Rangarajan et al. (2005) también se ha
sugerido que se necesita RgpB para la glucosilación postraduccional normal
de las arg-gingipaínas derivadas de rgpA, y que este proceso es necesario
para la estabilización de la enzima.
La regulación y la activación de las gingipaínas de P. gingivalis se conocen
poco. Sin embargo, Vanterpool et al. (2004) han presentado indicios de
que el gen vimE, que se encuentra hacia 3’ de vimA, se expresa de forma
independiente e interviene en la modulación de la actividad proteolítica en P.
gingivalis W83.
Mediante la hibridación Southern blot del ADN cromosómico de P. gingivalis
con sondas derivadas de rgpA se ha sugerido la presencia en el genoma
de esta bacteria de otros dos miembros de la familia de genes de la proteasa
y de la hemaglutinina (Aduse-Opoko et al., 1995; Barkocy-Gallagher et al.,
1996; Naskayama et al., 1995). El primero es el gen para la proteína de
superficie hemaglutinina A (hag A) que contiene cuatro repeticiones directas
que comparten una homología significativa en la secuencia con el área que
codifica la hemaglutinina de rgpA y kgp (Han et al., 1996). El segundo es una
adhesina unida a TonB (tla) que codifica la proteína de superficie involucrada
en la captura y utilización de la hemina. Ésta tiene una región interna
de 460 aminoácidos, con una homología del 98% con el dominio hemaglutinina
de RgpA.
Las gingipaínas de P. gingivalis afectan en gran medida al sistema de
defensa del huésped al degradar algunas citocinas, componentes del sistema
del complemento y varios receptores de las células inmunitarias. Mezyk-
Kope et al. (2005) observaron que las gingipaínas eran capaces no sólo de
degradar el TNF-a soluble, sino también de destruir la forma de esta citocina
asociada a la superficie de la membrana celular. Además, pensaban que de
esta forma podría modificarse la regulación de la red de citocinas. También
se ha demostrado, en cultivo de fibroblastos gingivales humanos que las gingipaínas
específicas de arginina estimulan la producción del factor de crecimiento
de hepatocitos (factor de dispersión) a través de los receptores
activados por proteasas (Uehara et al., 2005). Los mecanismos implicados
pueden participar activamente en los procesos inflamatorios y reparadores de
las enfermedades periodontales.
Yun et al. (2006) proporcionaron indicios de que las gingipaínas de P. gingivalis
pueden reducir la expresión funcional de CD99 en las células endoteliales,
provocando indirectamente la alteración de la expresión de las
moléculas de adhesión y del reclutamiento de los leucocitos en los focos
inflamatorios.
Sheets et al. (2006) habían demostrado antes que las gingipaínas de
P. gingivalis W83 pueden provocar la desinserción de las células, la rotura
de las moléculas de adhesión celular y la apoptosis en las células endoteliales,
pero no quedaban claras las funciones específicas individuales de las gingipaínas.
Estos autores utilizaron gingipaínas purificadas y determinaron que
cada una de ellas puede romper la molécula de adhesión celular en varios
grados y con una cinética diferente. Kgp y HRgpA actuaron a la vez para
desinsertar rápidamente las células endoteliales. Además, en ausencia de caspasas
activas, los extractos de gingipaína activa de W83 y la HRgpA y la
RgpB purificadas provocaban apoptosis, lo que sugiere que las gingipaínas
eran capaces de inducir apoptosis tanto de forma dependiente como independiente
de las caspasas.
Beikler et al. (2005) usaron células de P. gingivalis para estudiar las variaciones
de secuencia en el centro activo de los genes que codifican la proteinasa
específica de Arg-X, rgpA y rgpB, y analizaron su prevalencia en
pacientes con periodontitis, antes y 3 meses después del tratamiento periodontal
mecánico. Sin embargo, no hallaron ninguna variación específica en
la secuencia de rgpA en estas situaciones.