Periodoncia.Eley.6a.Ed

Mecanismos de producción de la enfermedad 61
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crecimiento, las enzimas se asocian principalmente a las células, pero a
medida que el cultivo envejece o en las velocidades de crecimiento lentas, la
proporción de actividad liberada al medio aumenta (Fujimura y Nakamura,
1989; Minas y Greenman, 1989; Suido et al., 1986; Tokuda et al., 1986). Una
importante proporción de la actividad está asociada a las membranas bacterianas
(Fujimura y Nakamura, 1989; Tsutsui et al., 1987; Yoshimura et al., 1984),
y las enzimas se localizan en la membrana interna de la célula y en la superficie
celular (Lantz et al., 1993). También se ha encontrado una actividad elevada
en las vesículas extracelulares de la membrana externa (Grenier y
Mayrand, 1987; Smalley y Birss, 1987), y la cantidad relativa varía de forma
similar a la del sobrenadante (Minhas y Greenman, 1989).
La enzima purificada es inhibida por los bloqueantes del tiol y potenciada
por los compuestos sulfhidrilo (Fujimura y Nakamura, 1987; Lantz et al.,
1993; Otsuka et al., 1987; Shah et al., 1991; Smalley y Birss, 1987; Sorsa et
al., 1987; Suido et al., 1987; Sundqvist et al., 1987; Tsutsui et al., 1987;
Yoshimura et al., 1984). Tiene acciones similares a otras cisteína proteinasas
habituales, como la papaína y, por analogía, se ha propuesto que sea conocida
como «gingipaína» o «gingivaína» (v. más adelante).
Existen estudios contradictorios sobre otras propiedades de la actividad
tipo tripsina. Algunos investigadores han observado que son sensibles a los
inhibidores de la serina proteinasa (Sorsa et al., 1987; Suido et al., 1987;
Sundqvist et al., 1987; Tsutsui et al., 1987), pero otros no (Fujimura y
Nakamura, 1987; Nilsson et al., 1985; Lantz et al., 1991a). Algunos grupos
también han observado que se necesitan iones metálicos (Yoshimura et al.,
1984; Fujimura y Nakamura, 1987; Sorsa et al., 1987; Sundqvist et al., 1987;
Tsutsui et al., 1987), pero otros no (Suido et al., 1987; Okamoto et al., 1998).
Por otra parte, los valores de pH óptimo oscilan entre 6,0 y 8,5 (Yoshimura
et al., 1984; Fujimura y Nakamura, 1987; Otsuka et al., 1987; Suido et al.,
1987; Sundqvist et al., 1987; Tsutsui et al., 1987), mientras que el peso molecular
estimado varía entre 18 y 300 kDa (Fujimura y Nakamura, 1987;
Otsuka et al., 1987; Lantz et al., 1993; Smalley y Birss, 1987; Sorsa et al.,
1987; Tsutsui et al., 1987).
La explicación más probable para estas variaciones es que hay más de una
enzima tipo tripsina. En este sentido, en un estudio se obtuvieron cuatro actividades
de proteinasa tipo tripsina diferentes y todas parecían clasificarse
como cisteína proteinasas (Fujimura y Nakamura, 1989). Otro estudio las
separó en tres cisteína proteinasas, dos de las cuales rompían enlaces de arginina;
otra, enlaces de lisina, y una cuarta proteasa se comportaba como una
serina proteinasa (Hinode et al., 1991). Otros autores han obtenido resultados
similares (Nakamura et al., 1991). Además, numerosos trabajos sobre las
proteinasas tipo tripsina incluyen descripciones de actividad colagenasa, lo
que podría deberse a la separación de las proteinasas colagenolíticas (v. más
adelante).
Shah et al. (1991) separaron la actividad tipo tripsina de P. gingivalis tanto
de las vesículas de la membrana externa como del sobrenadante del cultivo
de esta bacteria. Estos autores demostraron que se trata de una cisteína proteinasa
dependiente de tiol, que degrada sustratos de arginina sintética y propusieron
el nombre de gingivaína para esta enzima. Chen et al. (1992)
aislaron una proteinasa similar, y probablemente idéntica, del sobrenadante
del cultivo de P. gingivalis, a la que denominaron gingipaína. Estos autores
demostraron que tenía un espectro de actividad limitado frente a los enlaces
peptídicos que contenían arginina, que era resistente a la inhibición mediada
por los inhibidores de la serina proteinasa y que se activaba mediante las
dipeptidasas que contienen glicina. Observaron que tenía un peso molecular
de 50 kDa y un pH óptimo de 6,0 y sugirieron que esta enzima podía denominarse
arg-gingipaína o gingipaína-R.
Pike et al. (1994) también separaron la actividad tipo tripsina en el sobrenadante
de cultivos de P. gingivalis y observaron que había dos actividades
de cisteína proteinasa distintas, una con especificidad por la arginina y otra
por la lisina, respectivamente. La proteinasa específica de arginina era una
forma de gingipaína de alto peso molecular y resultó ser una gingipaína de
50 kDa que formaba un complejo con unas proteínas de unión de 44 kDa, que
resultaron ser hemaglutininas (Aduse-Opoku et al., 1995; Curtis et al.,
1993b). La proteinasa con actividad específica de lisina tenía un peso molecular
de 60 kDa y un pH óptimo de 8,0-8,5; y también formaba un complejo
con la hemaglutinina (Curtis et al., 1993b). Esta proteasa recibió el nombre
de lis-gingipaína, pero también se conoce como gingipaína-K. Se creía que
estos complejos de proteinasa/hemaglutinina podían intervenir en la captación
de hemina, un metabolito esencial para P. gingivalis, por medio de la
hemaglutinación y posterior hemólisis de los eritrocitos.
Scott et al. (1993) también aislaron e identificaron esta actividad específica
de lisina, y llamaron a esta enzima lis-gingivaína. Este grupo demostró
que podía degradar quininógenos de alto peso molecular para generar bradiquinina,
y que también podía degradar fibrinógeno. Esta proteasa también es
capaz de activar las colagenasas intersticiales de los fibroblastos y neutrófilos
(metaloproteinasas de la matriz [MMP] 1 y 8) (De Carlo et al., 1997;
Sorsa et al., 1992). Por tanto, parece que P. gingivalis produce dos cisteína
proteinasas con actividad tipo tripsina. Una de ellas es específica de arginina
y se llama arg-gingipaína o arg-gingivaína, y la otra es específica de lisina y
se llama lis-gingipaína o lis-gingivaína.
Los métodos para clonar los principales genes de la arginina y de la lisina
proteinasas han consistido en la exploración, en E. coli, del ADN genómico
de P. gingivalis utilizando oligonucleótidos dirigidos contra el anticuerpo
específico o su extremo N-terminal (Curtis et al., 1999). El primer gen clonado
y secuenciado fue arg-gingipaína-1(rgp-1) de la cepa HG66 (99),
seguido por la proteasa poliproteínica arg-1(prp-1) de la cepa W50, arg-gingipaína-A
(rgp-A) de la cepa 381, prpR de la cepa W50 y prpH de la cepa
W83 (Aduse-Opoku et al., 1995, 1996; Curtis et al., 1993b; Fletcher et al.,
1994; Kerzbaum et al., 1995; Lewis y Macrina, 1998; Okamoto et al., 1995;
Pavloff et al., 1995). En la actualidad se cree que todos estos genes están
estrechamente relacionados y que es probable que ocupen locus homólogos
en las diferentes cepas bacterianas (Curtis et al., 1999) y, por tanto, sería
legítimo utilizar un único descriptor para todos ellos, rgpA.
La secuencia de aminoácidos deducida de este gen (fig. 5.3) revela (Curtis
et al., 1999) un propéptido N-terminal, un dominio catalítico de 50 kDa y una
larga extensión C-terminal que codifica la hemaglutinina/adhesina (Aduse-
Opoko et al., 1995; Pike et al., 1994). Esta estructura del gen puede producir
la traducción de múltiples formas de proteinasa específica de arginina, que
diferentes grupos de investigación han descrito como dímeros y polímeros
(Curtis et al., 1999). El método Southern blot también reveló regiones de
homología en múltiples locus del cromosoma, lo que sugiere la presencia de
una familia de genes cuya secuencia está relacionada. Las sondas de ADN
para la región catalítica hibridaron con dos locus separados, lo que sugiere la
presencia de un segundo gen estrechamente relacionado. Por otra parte, las
sondas dirigidas contra la extensión C-terminal también hibridaron con múltiples
locus, sugiriendo la presencia de varios genes de secuencias relacionadas
con la actividad hemaglutinina (Aduse-Opoko et al., 1995; Barkocy-Ga -
llagher et al., 1999; Curtis et al., 1996; Nakayama et al., 1995).
Los estudios sobre la inactivación insercional del gen han demostrado la
existencia de un segundo gen específico de arginina. Estos estudios demostraron
que se necesitaban dos inserciones para suprimir toda la actividad
Fig. 5.3 Representación esquemática de la proteína prpR1 producida por el gen
prpR1 de P gingivalis. La proteína se compone de 1.706 aminoácidos y se organiza
en cuatro dominios mayores pro-, a, b y g. El propéptido va precedido de una
secuencia señal habitual de Escherichia coli. La presencia de residuos de arginina
en la unión de estos dominios sugiere un procesado autolítico de la poliproteína I,
indicado por las flechas verticales, para producir Arg1 (ab) dimérica o Arg1A (a)
monomérica. La anotación LPS junto a Arg1B indica la amplia modificación lipídica
de esta forma.