Сборник 69 конференции ВолгГМУ 27-30 апреля 2011

69-я открытая научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участиемУДК 576.851.132:616.982.27-033 К-69Е. В. ПименоваРАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITROНИПЧИ Роспотребнадзора. г. ВолгоградВолгоградский государственный университетНаучный руководитель: д.м.н., профессор Н. П. ХраповаВведение. Традиционные методы определенияпотенциально токсичных химических ибиологических веществ на лабораторных животныхтрудоемки, длительны и дорогостоящи. Альтернативойим являются методы оценки токсичностиразличных соединений на модели перевиваемыхклеточных культур. В мире накопленбольшой объем информации о преимуществахэтих методов как наиболее технологичных, объективных,точных и удовлетворяющих требованиябиоэтики [1, 2, 3]. При этом сведения об использованииклеточных моделей для выявлениятоксических свойств у ряда компонентов микробнойклетки возбудителя Burkolderia pseudomalleiотсутствуют.Цель работы: выбор клеточной моделии оптимизация условий постановки микровариантатеста цитотоксичности для изучения свойствразличных антигенных препаратов возбудителямелиоидаза.Материалы и методы. В работе использовалимонослойные клеточные линии мышиныхфибробластов L929 и клеток яичника китайскогохомячка CHO-K1, полученные из Российскойколлекции клеточных культур позвоночных институтацитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Выполнениеэкспериментов проводили с паспортизированнымилиниями клеток с хорошо изученнымисвойствами (морфология клеток, характерроста, питательные потребности), что обеспечиваловоспроизводимость результатов опытов.После выведения клеток из криоконсервированногосостояния их высевали на 12-ти луночныепланшеты для изучения динамики увеличениячисленности клеточных популяций (L929 иCHO-K1) в течение срока наблюдения (4 сут).Пластину инкубировали в СО 2 -инкубаторе при 37о С и насыщении атмосферы 6-7 % СО 2 .Период адаптации культур к условиямпроведения эксперимента после выхода из криоконсервированногосостояния составил 2-недельный период.Затем был выполнен этап подбора такойпосевной концентрации клеток на 1 см 2 площадилунок пластин различного формата, которая позволяладобиваться образования плотного монослояклеток в течение суток. Это обеспечилообъективную оценку изменения морфологии клетокво всех участках дна просматриваемой лунки.При посевах в виде изолированных участков монослояневозможно выявить появление свободныхот клеток участков пластика как следствие ихлизиса, обусловленного воздействием антигена.Для скрининговой оценки цитотоксичности10 различных антигенов возбудителя мелиоидоза,изолированных из капсульной субстанцииB. pseudomallei, клеточной стенки и водорастворимойчасти ультразвукового дезинтеграта микробныхклеток, использовали микровариант тестацитотоксичности.Культуру клеток двух линий высевали в48-луночные пластины, по 6×10 4 клеток в лунку.Через сутки после образования монослоя, вносилипо 10 мкл испытуемых антигенов. Просмотрлунок с культурами осуществляли ежедневно втечение 4 сут. При просмотре оценивали морфологиюи функциональное состояние клетокмишеней.Критериями оценки получаемых результатовявлялись морфологические измененияклеток-мишеней и нарушение функции распластыванияклеток на поверхности пластика. Приоценке результатов учитывали факторы времениконтакта антигенов с клетками и концентрациивносимых веществ в среду их выращивания.Влияние препаратов на клетки-мишени былоразличным в диапазоне от цитотоксического воздействиядо минимальных изменений (цитопатогенныйэффект).В случае выраженного токсического воздействияморфологические изменения клетокмишенейрегистрировали через сутки после контактас антигенами.Обе клеточные линии обеспечивали получениесопоставимых результатов. Разработаннаяметодика оказалась пригодной для работы сразличными биологическими активными комплексами,а также с фракциями сложных антигенныхпрепаратов.Вывод. Таким образом, в результатепроделанной работы определена клеточная модельдля оценки цитотоксичности антигенов B.pseudomallеi, оптимизированы условия выполнениямикроварианта теста цитотоксичности и критерииоценки его результатов.Литература1. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клетоккак модельная система исследованиятоксичности и скрининга цитопротекторныхпрепаратов// СПб. – 2003. – 240с.179