2º Congreso Argentino De Fitopatología Libro de Resúmenes

DETECCIÓN DE LA CLOROSIS VARIEGADA DE LOS
CITRUS (CVC) POR PCR SIN EXTRACCIÓN DE DNA
CONVENCIONAL
R.M. Haelterman, P.A. Tolocka y M.L. Otero. IFFIVE-INTA. Camino 60 cuadras
km 51/2. Córdoba. rhaelt@correo.inta.gov.ar
La clorosis variegada de los citrus (Xylella fastidiosa), puede ser
diagnosticada por serología, pero el análisis molecular es importante
para confirmar un diagnóstico cuando la concentración del patógeno
es baja. El objetivo de este trabajo fue implementar la PCR,
simplificando la extracción del DNA partiendo de la misma molienda
de la prueba serológica. Se maceraron pecíolos de naranjo con CVC
en distintas diluciones (1/2, 1/5 y 1/10 P/V) con tampón extracción
(PBS+Tween 20+PVP+sulfito de sodio+albúmina de huevo). Se
sembraron 20ul del homogenato sobre papel nucleico (Biodynamics)
dejándolo secar. Posteriormente se cortaron pequeños porciones del
papel, se introdujeron en tubos de 1,5 ml, conteniendo agua libre de
nucleasas (50 y 100ul), y se llevaron a 95ºC durante 10 min. Para
la reacción de PCR fueron empleados 10ul de esta suspensión. De
las mismas plantas enfermas se extrajo el DNA con kit de Qiagen,
utilizando 1ul de DNA en la reacción de PCR. La misma se realizó con
dos juegos de primers, por un lado los universales (RST 31-RST 33)
que amplifican una banda de 730pb y por otro, unos específicos para
esta variante (HL5-HL6) de 221pb. Ambos detectaron la bacteria,
obteniendo bandas más fuertes con los HL5-HL6. La dilución y
el volumen óptimo fueron 1/5 (P/V) y 100ul, respectivamente. La
comparación de las bandas obtenidas con los primers HL5-HL6 por
este método y con DNA extraído de kit, fueron de igual intensidad.
Se realizaron diluciones de la suspensión de DNA 1/10, 1/20 y 1/50,
dando resultado positivo hasta la máxima dilución.
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