Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

140 C. Cremer
derfolgenden optischen Schnitten kleiner als die Hälfte der axialen Halbwertsbreite
der Punktbildfunktion sein.
Als ein weiterer Parameter zur Charakterisierung der Leistungsfähigkeit
eines 3D-Mikroskops wird auch das Beobachtungsvolumen Vobs angegeben; es
wird definiert als das Volumen eines Ellipsoids mit den Achsen FWHMx,y/2
und FWHMz/2. Bei herkömmlichen Fluoreszenzhochleistungsmikroskopen
ist die FWHMx,y und damit die laterale Entfernungsauflösung in der Objektebene
zwischen zwei mit gleicher spektraler Signatur markierten Targets
etwa 200 nm. Die experimentell bestimmte axiale FWHM (und damit die
axiale Auflösung) beträgt unter biologisch relevanten Bedingungen hingegen
etwa ein bis mehrere µm. Ob zwei punktförmige Targets als getrennt
registriert werden können, hängt wegen der in lateraler und axialer Richtung
unterschiedlichen FWHM von dem Abstand der Targets voneinander
sowie von dem Winkel ab, den sie mit der optischen Achse des Mikroskopsystems
bilden. Zwei in derselben Ebene befindliche Targets beispielsweise
könnenindemgewählten Beispiel noch bei einem Abstand von 200 nm unterschieden
werden; zwei genau übereinander liegende Targets können nur
dann von einander getrennt werden, wenn ihr axialer Abstand größer ist
alseinbismehrereµm. Die gesamte mittlere 3D-Auflösung eines aus Punkten
gleicher spektraler Signatur bestehenden Objekts beträgt daher ebenfalls
etwa 1 µm. Da ein Zellkern, ein menschlicher Lymphozyt beispielsweise, jedoch
nur einen Gesamtdurchmesser von typischerweise 10 µm hat,isteine
Analyse der 3D-Feinstruktur des Genoms mit dem beschriebenen Verfahren
der konventionellen Epifluoreszenzmikroskopie hoher numerischer Apertur
unter Verwendung von markierten Targets gleicher spektraler Signatur nicht
möglich. Die gleiche Konsequenz ergibt sich auch, wenn man das Beobachtungsvolumen
betrachtet: Mit lateralen FWHM von 200 nm sowie einer axialen
FWHM von 1 µm ergibt sich Vobs = 0,021 µm 3 . Bei einem Gesamtvolumen
eines sphärisch angenommenen Zellkerns von 10 µm Durchmesser von
524 µm 3 erscheint das genannte Beobachtungsvolumen zunächst relativ klein
zu sein. Vergleicht man es jedoch mit dem DNA-Gehalt eines derartigen Kerns
von ca. 7 × 10 9 Basenpaaren (bp), so liegen im Mittel in einem derartigen
Beobachtungsvolumen noch rund 280 Kilobasenpaare (kbp) an DNA: Eine innere
räumliche Struktur solcher bereits relativ großer Gebilde kann demnach
auf die beschriebene Weise (d.h. bei Markierung von Zielsequenzen innerhalb
des Beobachtungsvolumens mit Fluorochromen gleicher spektraler Signatur)
nicht mehr mit Methoden der Fernfeld-Lichtmikroskopie (Arbeitsabstand
Objektiv-Target viele Wellenlängen) analysiert werden.
8.2.2 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Zur historischen Entwicklung. Die konfokale Laserscanningfluoreszenzmikroskopie
(CLSFM) entwickelte sich seit den 60er Jahren aus zwei Wurzeln:
der konfokalen Mikroskopie von transmittiertem und reflektiertem Licht auf