Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

8 Konfokale Mikroskopie in der Genomforschung 141
der Grundlage konventioneller Lichtquellen, und aus der Weiterentwicklung
von Lasermikrobestrahlungstechniken von Zellen.
Konfokale Mikroskopie mit konventionellen Lichtquellen. Um die
” Schärfentiefe“ der optischen Schnitte zu vermindern und damit die räumliche
Entfernungsauflösung bei zellulären Objekten wesentlich verbessern zu
können, mussten grundsätzlich neue Wege der hochauflösenden, dreidimensionalen
Lichtmikroskopie gefunden werden. Eine derartige Möglichkeit wurde
vor rund 40 Jahren vorgeschlagen ([66]; zur historischen Entwicklung s. [64]):
die konfokale Scanningmikroskopie. Minskis Vorstellungen zufolge wird das zu
untersuchende Objekt punktweise“ mit einer konventionellen (inkohärenten)
”
Lichtquelle beleuchtet. Das vom Objekt reflektierte oder transmittierte Licht
wird jeweils registriert, und die so erhaltenen Signale werden dann zu einem
Bild des Objekts zusammengesetzt. Die entscheidende neue Idee des Scanningverfahrens
war die konfokale“ Detektion, d.h. die Anbringung einer kleinen
”
Blende in der Bildebene des Mikroskopobjektivs. Diese Blende wurde so klein
gewählt, dass sie nur das Licht aus der jeweils eingestellten Objektebene zum
Detektor durchließ; die Schärfentiefe sollte auf diese Weise drastisch vermindert
und die 3D-Auflösung daher erheblich verbessert werden können.
Konfokale Laserscanningfluoreszenzmikroskopie (CLSFM). Eine
notwendige Voraussetzung für die Entwicklung der hochauflösenden Laserscanningfluoreszenzmikroskopie
war die beugungsbegrenzte Fokussierung von
kohärentem Licht durch Optiken hoher numerischer Apertur; die Frequenz
des kohärenten Lichts musste genügend hoch sein, um eine spezifische Anregung
von biologisch relevanten Fluoreszenzfarbstoffen zu gestatten; die Anregungsintensität
musste eine ausreichende Konstanz besitzen. Daraus folgte
als praktische Konsequenz der Einsatz von Gaslasern mit einer Wellenlänge
≤ 500 nm bzw. die Frequenzverdoppelung von kohärentem Licht größerer
Wellenlänge.
Bereits wenige Jahre nach der Entdeckung des Lasers wurden Laserstrahlen
mit Hilfe von Mikroskopobjektiven beugungsbegrenzt fokussiert und
zur gezielten Mikrobestrahlung von kleinen Arealen von Zellen eingesetzt. Im
Vordergrund stand damals vor allem die Ausschaltung ausgewählter zellulärer
Bereiche durch gepulstes Laserlicht im sichtbaren und nahen ultravioletten
Wellenlängenbereich. Andere Arbeitsgruppen befassten sich mit Auswirkungen
durch Mikrobestrahlung relativ geringer Intensität mit Hilfe von kontinuierlichen
Gaslasern. Frequenzverdoppeltes, beugungsbegrenzt durch ein
Mikroskopobjektiv hoher numerischer Apertur fokussiertes Licht der 514,5nm-Emission
eines Argon-Ionen-Lasers ergab z.B. erste direkte Belege, dass
auch in Säugerzellen in vivo die Chromosomen normalerweise in Territorien
angeordnet sind [24,108]. Andere Anwendungen der Laser-UV-Mikrobestrahlungstechnik
betrafen Untersuchungen zur Entwicklungsbiologie der Drosophila
[59, 60, 70].