Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

182 S.W. Hell
nicht ersetzen kann. Fernfeldmikroskope mit höherer Auflösung wären daher
von erheblicher praktischer Bedeutung. Die Beugung stellt allerdings eine
erhebliche Herausforderung dar.
9.2 Die Punktabbildungsfunktion
als dreidimensionale Sonde
Würde man versuchen, die Auflösung eines konventionellen Lichtmikroskops
zu erhöhen, so ginge das zwar auch, aber man hätte eine eher ungünstige
Ausgangsposition. Eine bessere Ausgangsposition hat man, wenn man das
Objekt mit einem oder mehreren Strahlen abrastert. Und am einfachsten
ist es, wenn das Objekt mit einem fokussierten Strahl Punkt für Punkt
abgerastert wird und die seriell gespeicherten Intensitätwerte anschließend
in einem Bild dargestellt werden. Die zur Zeit leistungsfähigsten Fluoreszenzrastermikroskope
sind das konfokale und das Multiphotonenrastermikroskop.
Beide sind Fernfeldverfahren. Während das konfokale Mikroskop bereits einen
Stammplatz in der biologischen Mikroskopie erobert hat, ist das Multiphotonenmikroskop
erst dabei, sich einen solchen zu erobern.
9.2.1 Das konfokale Fluoreszenzrastermikroskop
Das konfokale Fluoreszenzrastermikroskop beleuchtet nicht uniform, sondern
verwendet eine Punktlichtquelle. Man bevorzugt Laser, weil sie aufgrund ihrer
hohen Strahldichte genügend Licht zur Verfügung stellen können, um die
Farbstoffe effizient anzuregen. Das vom Objekt emittierte Licht wird üblicherweise
von demselben Objektiv registriert und auf einen punktförmigen Detektor
fokussiert, der sich optisch konjugiert zur Punktlichtquelle befindet. Die
Punktlichtquelle realisiert man, indem man eine kleine Lochblende beleuchtet
und diese in das Objekt abbildet. Der Punktdetektor wird zumeist mit Hilfe
einer Lochblende, die sich unmittelbar vor dem Detektor befindet, realisiert.
Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor sind zueinander optisch
konjugiert (Abb. 9.1).
Der Clou dieser Anordnung ist, dass aufgrund der Punktförmigkeit der
Lichtquelle und des Detektors ein effektiver Fokus entsteht, der sich genau
besehen wie eine ” Sonde“ verhält. Um im konfokalen Mikroskop ein Bild zu
erhalten, muss man die Probe durch ” die Sonde“ in allen Raumrichtungen
durchrastern und den Intensitätswert registrieren. Auf diese Weise lässt sich
ein dreidimensionales Bild eines transparenten Objekts erstellen.
Die Eigenschaft des konfokalen effektiven Fokus als dreidimensionale,
räumlich begrenzte Sonde kann man physikalisch auf anschauliche Weise
verstehen; das quantitative Verständnis erfordert ein paar Grundlagen der
Beugungstheorie. Die von der punktförmigen Lichtquelle ausgehende Wellenfront
wird vom Objektiv teilweise gesammelt und von diesem idealerweise in
ein Kugelwellenfrontsegment umgewandelt, das laut geometrischer Optik auf