Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

224 M. Hausmann
Aufgrund dieser einfachen Darstellung wird klar, dass Vorwärtsstreulicht
ein relativer Größenparameter, während Seitwärtsstreulicht eher ein relativer
Formparameter ist. Streulichtparameter werden daher meistens auch
eingesetzt, um bei spezifischen Fluoreszenzmarkern Zellen von Debris (Zellbruchstücken
etc.) zu diskriminieren.
Fluoreszenzmessungen liefern bei den meisten biologischen Objekten die
wesentliche Information. Eine Vielzahl von Farbstoffen und insbesondere
Farbstoffantikörperkomplexen unterschiedlicher Spezifität stehen heute dem
Nutzer kommerziell zur Verfügung. Je nach Ausrüstung verfügen Flusszytometer
über 2–6 Photomultiplier teilweise unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit.
Diese Photomultiplier werden entlang des Detektionsstrahlengangs
angeordnet, der senkrecht zum Probenstrahl und zum anregenden
Laserstrahl steht. Neben Seitwärtsstreulicht können so bis zu fünf Fluoreszenzfarben
simultan detektiert werden. Prinzipiell kann die Zahl der Detektoren
jedoch auch höher sein. Dabei müssen die Detektionskanäle durch
eine geeignete Kombination optischer Filter spektral separiert werden. Zur
Verfügung stehen:
1. Bandpassfilter (bp), deren Transmissionsspektrum durch die Halbwertsbreite
um die Maximalwellenlänge gegeben ist;
2. (dichroitische) Langpassfilter (lp), die oberhalb eines bestimmten Wellenlängenwertes
(gegeben durch den 50% Kantenwert) transmittieren;
3. (dichroitische) Kurzpassfilter (kp), die unterhalb eines bestimmten Wellenlängenwertes
(gegeben durch den 50% Kantenwert) transmittieren.
Dabei nutzt man aus, dass verschiedene Fluorochrome mit derselben Laserwellenlänge
angeregt werden können, sich jedoch in ihrem Emissionsspektrum
unterscheiden. Hierzu eignen sich besonders kombinatorische Farbstoffkonjugate,
wie z.B. Phycoerythrin/Texas Red oder Phycoerythrin/Cyanin 5, bei
denen der erste Farbstoff absorbiert und über direkten Energietransfer den
zweiten zur Fluoreszenzemission anregt. In Tabelle 10.1 soll für die nacheinander
folgende Anordnung der Detektionskanäle ein Beispiel gegeben werden.
Tabelle 10.1. Anregung bei 488 nm (Argon-Ionen-Laser)
Detektionskanal 1: Dichroit 500 nm lp + 488/10 nm bp
für Streulicht
Detektionskanal 2: Dichroit 560 nm lp + 530/30 nm bp
für Fluorescein Fluoreszenz
Detektionskanal 3: Dichroit 600 nm lp + 580/30 nm bp
für Phycoerythrin Fluoreszenz
Detektionskanal 4: Dichroit 640 nm lp + 620/30 nm bp
für Phycoerythrin/Texas Red Fluoreszenz
Detektionskanal 5: 660 nm lp für Phycoerythrin/Cyanin 5 Fluoreszenz