Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 191
emission sonst nicht mehr proportional zur Beleuchtungs-PSF hill(u, v) ist.
Weil hill(u, v) bei(0, 0) ein Maximum besitzt, wird Sättigung zuerst im geometrischen
Fokuspunkt einsetzen und bei gesteigerter Intensität zu einer disproportionalen
räumlichen Ausweitung der Anregung führen. Dies ist gleichbedeutend
mit einer Verschlechterung der Auflösung und der axialen konfokalen
Diskriminierung.
Die fokale Intensität ist zwar die entscheidende Größe, aber für den Praktiker
ist die durch das Objektiv passierende Durchschnittleistung P von
größerer Bedeutung, weil sie direkt messbar ist. Mit Hilfe von (9.1) lässt sich
die Fläche des fokalen Hauptmaximums als π � �
∆r 2
2 abschätzen, was in etwa
der Fläche innerhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums entspricht.
I ≈ 4P
�
≈ 3,4P n sin
π∆r2 α
�2 . (9.6)
λ
Aufgelöst nach der Durchschnittsleistung P erhält man unter der Annahme,
dass die halbe Sättigungsintensität eine Obergrenze darstellt,
P ≤ 0,15�ωλ2
στn2 sin 2 . (9.7)
α
Verwendet man ein hochauflösendes Ölimmersionsobjektiv der Apertur
(n sin α) =1, 35, so berechnet man für Rhodamin B eine zulässige Durchschnittsleistung
von P ≤ 0, 25 mW. Bei höheren Durchschnittsleistungen
lassen sich keine brauchbaren Signalsteigerungen mehr erzielen. Desweiteren
muss man bedenken, dass ein Molekül im Durchschnitt nur etwa 5 000- bis
10 000-mal fluoreszieren kann, bevor es einen irreversiblen Zerstörungsprozess
erleidet. Die bisher angestellten Betrachtungen gelten alle für ein Molekül;
natürlich hängt das Signal auch von der Konzentration der Moleküle im
Objekt ab. Als Richtwert kann man angeben, dass sich im (abgeschätzten)
Fokalvolumen eines hochaperturigen Objektivs (π × 200 2 × 600 µm 3 )biszu
1000 Fluoreszenzmoleküle befinden können; oft aber um 1–2 Größenordnungen
weniger.
Regt man das Molekül im Zweiphotonenmodus an, so gilt für die Absorptionsrate
k2 =
2 σ2I
, (9.8)
(�ω) 2
wobei σ2 den Zweiphotonenwirkungsquerschnitt bezeichnet und in cm 4 sgemessen
wird. Aufgrund der quadratischen Abhängigkeit des Anregungsprozesses
von der Intensität und der ungewöhnlichen Einheit verliert der Wirkungsquerschnitt
die anschauliche Bedeutung, die er in der Einphotonenabsorption
hat. Dennoch lässt er sich mit Hilfe einer – quantenmechanisch
nicht ganz korrekten – Überlegung veranschaulichen. Um gleichzeitig am
Ort des Moleküls zu sein, dürfen die absorbierten Photonen nicht mehr
als λ/4 voneinander entfernt sein. Licht legt diese Strecke in der Zeit θ =