Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

11 Optische Datenerfassung und -verarbeitung 243
ten, parallelen Übertragungsfunktion – dies ist i. Allg. nicht dasselbe. Für eine
einfache, zirkulare Pupille ist es aber doch dasselbe, weil die Pupillenfunktion
reell und x und y symmetrisch ist.
Um ein vollständiges Bild eines Objekts zu erhalten, werden im ersten
Schritt die konfokalen Bilder für verschiedene vertikale Ebenen gemessen.
Anschließend müssen die gemessenen ” Scheiben“ zu einem Objektbild zusammengesetzt
werden. Im Ergebnis erhalten wir ein mikroskopisches Bild mit
hoher Tiefenschärfe, ohne dass die laterale Auflösung verringert wird, wie es
zur Erhöhung der Tiefenschärfe in der konventionellen Mikroskopie geschehen
muss.
Wie geht dieses nachträgliche Zusammensetzen des Bildes vor sich? Das
einfachste Verfahren ist der ausgedehnte Fokus (extended focus). Hier wird
für jeden Pixel das Integral über die vertikal gemessene Intensitätsverteilung
gebildet. Man erhält damit Bilder, die aussehen wie normale mikroskopische
Aufnahmen, aber mit extrem großer Tiefenschärfe bei gleichzeitig hoher
numerischer Apertur.
11.1.3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Wegen der Möglichkeit, optische Schnitte durch transparente Objekte zu
legen, ohne die Objekte zerstören zu müssen, erfreut sich die konfokale Mikroskopie
gerade in Medizin und Biologie außerordentlicher Beliebtheit. Ein
Hauptanwendungsgebiet dort ist die Fluoreszenzmikroskopie. Durch Mikroinjektion
bestimmter Farbstoffe werden Zellbestandteile wie Proteine und Lipide
spezifisch angefärbt. Bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge λ1 emittieren
sie Fluoreszenzlicht einer (normalerweise größeren) Wellenlänge λ2.
Damit kann die räumliche Verteilung der so markierten Substanzen sichtbar
gemacht werden. Speziell in der Genetik werden synthetisierte DNA-Stücke
mit Farbstoffmolekülen markiert und in eine zu analysierende DNA-Kette
eingebaut. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die räumliche Verteilung im
Chromosom sichtbar gemacht werden.
Hier trifft es sich gut, dass das Auflösungsvermögen der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
im Vergleich zur ” normalen“ kohärenten, konfokalen
Mikroskopie nochmal um ca. den Faktor 2 besser ist. Diese genügte aber
bereits der (inkohärenten) Rayleigh-Auflösungsgrenze von λ
2NA .Inderkonfokalen
Fluoreszenzmikroskopie unterbieten wir also deutlich die Rayleigh-
Auflösungsgrenze.
Der Schlüssel für diesen Effekt ist die Tatsache, dass für die Anregung des
Fluoreszenzlichts nicht die Amplitude der Anregung, sondern die Intensität
des einfallenden Lichts wesentlich ist. Außerdem wird das Fluoreszenzlicht
inkohärent abgestrahlt, d.h. vom Objektiv wird die Intensität linear übertragen.
Die Punktantwort für diesen Fall können wir analog zum vorhergehenden
Abschnitt herleiten: Beleuchten wir ein Molekül mit einer ebenen Welle der
Anregungswellenlänge λ1. Daraufhin wird Licht der Wellenlänge λ2 emittiert.