Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

230 M. Hausmann
10.4 Fluoreszenzmarkierung
Die für die Flusszytometrie wichtigsten Eigenschaften eines Fluoreszenzfarbstoffs
sind dessen Absorptionsspektrum, für das geeignete Laserwellenlängen
zur Verfügung stehen müssen, und dessen Emissionsspektrum, das möglichst
wenig mit dem anderer Farbstoffe überlappen soll, sodass es durch geeignete
Filter separierbar ist. Schließlich spielen Quanteneffizienz und Photostabilität
eine weitere Rolle für die Sensitivität der Messung. Daneben muss beachtet
werden, dass Fluorochrome ihre spektralen Eigenschaften abhängig von ihrer
molekularen Umgebung, dem pH, der Anwesenheit bestimmter Ionen usw.
ändern können. Dies nutzt man z.B. bei DAPI, dessen Fluoreszenzintensität
bei Anlagerung an doppelsträngige DNA etwa um einen Faktor 18 steigt,
oder Acridine Orange, dessen Fluoreszenzwellenlänge von der Bindung an
einzelsträngige (rot) oder doppelsträngige (grün) Nukleinsäuren abhängt. Ein
anderes Beispiel stellen die bereits besprochenen kombinatorischen Farbstoffkonjugate
oder das Quenchen der Fluoreszenz von Hoechst 33342 in Anwesenheit
von Bromdesoxyuridin dar.
Es gibt grundsätzlich zwei Klassen von Fluorochromen in der Flusszytometrie;
die einen binden mehr oder weniger spezifisch direkt an innere
Strukturen von Zellen (z.B. DNA), die anderen binden an spezifische Sonden.
Monoklonale Antikörper sind hierbei die am meisten verwendeten Sonden.
Durch ihren Einsatz hat sich die Flusszytometrie auf ihrem Hauptanwendungsgebiet,
der immunologischen Zellcharakterisierung, weltweit zu einer
Routinetechnik entwickelt, die in nahezu jeder größeren Klinik zu finden ist.
Monoklonale Antikörper sind entweder direkt (kovalent) mit Farbstoffen
markiert oder indirekt, z.B. über eine Biotin-Streptavidin-Brücke oder über
einen weiteren Antikörper gegen Immunglobulin. Dies wird ausführlich in
dem am Ende zitierten Buch von Polak und van Noorden beschrieben. Mittlerweile
ist jedoch ein breites Spektrum direkt markierter monoklonaler Antikörper
und markierter Antiimmunglobuline von verschiedenen Herstellern
kommerziell erhältlich, sodass es selten notwendig sein wird, eigene Reagenzien
im Labor herzustellen. Tabelle 10.2 fasst einige Fluorochrome für die
Antikörpermarkierung und ihre Absorptions- und Emissionsmaxima im ungebundenen
Zustand zusammen.
Von der zweiten Klasse an Fluorochromen, die spezifisch an innere Zellstrukturen
bilden, stellen die, die stochiometrisch an Nukleinsäuren binden,
für quantitative Messungen in der Zellbiologie und Zytogenetik die wichtigste
Gruppe dar. So können hiermit z.B. Zellzyklusuntersuchungen über DNA-
Histogramme, Vitalitätsuntersuchungen in der Strahlenbiologie, Untersuchungen
zur Zellproliferation und zu Apoptose, aber auch Flusskaryotypisierung
oder biologische Dosimetrie durchgeführt werden. Tabelle 10.3 fasst einige
dieser Farbstoffe und ihre Absorptions- und Emissionsmaxima im an Nukleinsäuren
gebundenen Zustand zusammen.