Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 203
unter Verlust von Fluoreszenzlicht sinnvoll einsetzen, um die PSF zu verengen
und die Auflösung zu steigern. Der Punktdetektor gewährleistet, dass
nur das Licht gemessen wird, das vom Objektpunkt direkt in die Lochblende
abgebildet wird. Analog zum konfokalen Mikroskop muss man jetzt eine
Detektions-PSF berücksichtigen, was zu folgender effektiven PSF führt:
h conf
2−Phot(u, v) =h 2 ill
� u
2
, v
2
�
hdet(u, v) . (9.12)
Aufgrund der etwa halb so kurzen Fluoreszenzwellenlänge ist die Detektions-
PSF im Vergleich zur Beleuchtungs-PSF nur etwa halb so ausgedehnt. Daher
schneidet die Detektions-PSF quasi den Innenbereich der Beleuchtungs-PSF
heraus, sodass die effektive PSF insgesamt enger wird. Dies lässt sich sowohl
aus Abb. 9.2d als auch aus den dazugehörigen Profilen (Abb. 9.3) entnehmen.
Mit der deutlichen Verengung der PSF ist auch ein Signalverlust verbunden,
was insbesondere bei streuenden Proben nachteilig ist. Darüber hinaus
erfordert die Verwendung der Lochblende eine – sonst überflüssige – präzise
Justage. In Einzelfällen kann aber das Verwenden von Lochblenden vorteilhaft
sein. Man kann beispielsweise etwas größere Lochblenden wählen (vom
Radius v = 5–7 in optischen Einheiten), die nur zu relativ geringen Signaleinbußen
führen. Ist die PSF mit sphärischen Aberrationen behaftet, so
lassen sich damit merkliche Verbesserungen der axialen Auflösung erzielen
–ineinemvernünftigen Kompromiss zum SNR. Falls genügend Bildaufnahmezeit
oder Signal vorhanden ist, kann man die Auflösung der Zweiphotonenmikroskopie
an die der 1-Photonen konfokalen Mikroskopie heranführen
(Abb. 9.3a,b). Der effektive Fokus wird enger und damit auch die Sonde mit
der das Objekt abgerastert wird.
9.3 Point-Spread-Function-Engineering als Ansatz
zur Auflösungserhöhung im Fernfeldmikroskop
Der effektive Fokus als dreidimensionale Sonde ist ein idealer Ausgangspunkt
für die Auflösungserhöhung im Fernfeldlichtmikroskop. Die Auflösungserhöhung
reduziert sich somit auf die Frage: Wie kann man – unter Beibehaltung
eines möglichst hohen Signals – die spatiale Ausdehnung des effektiven Fokus
verringern? In Anbetracht der Tatsache, dass die axiale Auflösung mindestens
dreimal schlechter ist als die laterale, bietet es sich zunächst an, die axiale
Auflösung zu steigern. Dabei ist die Erhöhung der axialen Auflösung nicht
weniger wichtig als die der lateralen. Der dreidimensionale Charakter der
PSF bedingt, dass sie genauso zur Gesamtunschärfe beiträgt wie die laterale.
Es ist naheliegend und sicherlich auch einfacher, als Erstes die Erhöhung der
axialen Auflösung in Angriff zu nehmen.