Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

8 Konfokale Mikroskopie in der Genomforschung 149
Immersionsöl n = 1,518). Die auf diese Weise erhaltenen Mittelwerte für
die laterale und die axiale FITC-FWHM waren mit 430 nm (lateral) bzw.
840 nm (axial) zwar deutlich höher als die theoretischen (idealen) Werte [45];
die minimalen Messwerte lagen jedoch bei 222 nm (lateral) und 664 nm (axial).
Möglicherweise spiegelt die Variation tatsächliche Unterschiede in den
individuellen konfokalen PSF wieder. Eine solche Variation der für eine bestimmte
Zelle des relevanten PSF könnte hervorgerufen werden z.B. durch
unterschiedliche Brechungsindexvariationen und/oder durch unterschiedliche
axiale Positionierungen der Fluoreszenztargets im biologischen Objekt [46]
oder auch durch Veränderungen in den apparativen Parametern des CLSFM
zwischen verschiedenen Aufnahmen.
Da zur Durchführung der hier skizzierten FWHM-Abschätzung ” in situ“
nur noch der 3D-Daten-Satz eines Objekts mit geeigneter Markierung benötigt
wird, lassen sich auf diese Weise auch ohne Kenntnis der technischen
Mikroskopparameter Aussagen über die tatsächlich erzielte 3D-Auflösung
gewinnen.
Positionierungsgenauigkeit. Der erste Schritt zu einer Hochpräzisionsmessung
von 3D-Distanzen aus konfokalen Bilddaten ist die genaue Lokalisierung
der Schwerpunkte der interessierenden Targets im Bildraum ([62].
CLSFM-Messungen an FITC-markierten Fluoreszenz-Latex-Beads von
1 µm Durchmesser [11] unter Anwendung des in Kap. 8.2.4 und 8.2.5 beschriebenen
Auswertungsverfahrens ergaben Positionierungsfehler von 7,4 nm
lateral (x, y), 19,2 nm axial (z), und 11,4 nm in 3D (x, y, z). Der Gesamtfehler
(x, y, z) war dabei etwas kleiner als der Fehler in axialer Richtung; dies zeigt,
dass die Messfehler voneinander abhängig sind. Der Positionierungsfehler gibt
eine obere Grenze für die Genauigkeit der unter den gegebenen Bedingungen
erreichbaren Distanzmessung zwischen Targets an; den genannten Messergebnissen
zufolge liegt dieser bei dem hier verwendeten CLSFM (1 Photonenabsorption)
sowie der Markierung mit dem Fluorochrom FITC und einem
realistischen Signal-Rausch-Verhältnis bei ca. 10–20 nm (x, y, z). Bei axialtomographischer
CLSFM ergaben sich bei geeigneter Rotation der Targets in
die Objektebene noch etwas kleinere 3D-Positionierungsfehler (8,9 nm).
Erste Messungen des Positionierungsfehlers [11] wurden auch direkt in
menschlichen Zellkernen an FISH-markierten Zentromerregionen vorgenommen
(FITC-Fluoreszenz). Es ergaben sich bei dem normalen CLSFM-Verfahren
(Zellen auf Objektträgern fixiert) Positionierungsfehler von 34 nm lateral
(x, y), 39 nm axial (z), und 36 nm in 3D (x, y, z). Bei axialtomographischer
CLSFM ergaben sich bei optimaler Rotation der auf Glasfasern fixierten und
in situ hybridisierten Zellen jedoch erheblich kleinere, mit den o.g. Fluoreszenzbeadmessungen
vergleichbare 3D-Positionierungsfehler (12 nm).
Simulationsrechnungen unter Einbeziehung der bildanalytischen Positionsbestimmung
(Bornfleth, unveröffentlichte Resultate) zeigten, dass bei einer
besseren Fluoreszenzphotonenstatistik (um mehrere Größenordnungen) noch