Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

192 S.W. Hell
λ/(4c) =π/(2ω) ≈ 0.8fs zurück. Innerhalb dieser Zeit kann das Molekül
quasi nicht zwischen einem und zwei Photonen unterscheiden. Man kann
sich den Zweiphotonenprozess als Abfolge zweier Einzelphotonenabsorptionen
vorstellen, wobei das erste Photon das Molekül in einen ” virtuellen“
Zwischenzustand der Lebensdauer θ anhebt. Die Komplettierung der Absorption
erfolgt dann durch das zweite Photon. Aus dieser Überlegung kann
man ein Gefühl für die Rate der Zweiphotonenabsorption k2 bekommen, die
sich demnach aus dem Produkt von Einphotonenraten und der Lebensdauer
des virtuellen Zustands abschätzen lässt: (σ1I/(�ω)) 2 θ = I 2 (σ1/�ω 3/2 ) 2 π/2.
Vergleicht man mit (9.8), so findet man die quadratische Abhängigkeit von
der Intensität wieder, wie auch eine Abschätzung für σ2 ≈ (σ1) 2 π/(2ω) =
(σ1) 2 λ/(4c). Setzt man beispielsweise die Werte für Rhodamin B ein, so
erhält man mit λ ≈ 900 nm, σ1 ≈ 10 −16 cm 2 einen Zweiphotonenwirkungsquerschnitt
von σ2 ≈ 7,5 × 10 −48 cm 4 s. Dies ist in der Tat ein vernünftiger
Richtwert. Spektroskopische Messungen von Rhodamine B gelöst in Methanol
ergeben in diesem Wellenlängenbereich σ2 ≈ 7–20 × 10 −49 cm 4 s. Tabelle 9.1
fasst ein paar Wirkungsquerschnitte gängiger Farbstoffe zusammen.
Die Notwendigkeit, zwei Photonen gleichzeitig zu absorbieren, weist darauf
hin, dass für die Zweiphotonenabsorption hohe Intensitäten vorteilhaft
oder erforderlich sind. Mit Hilfe von (9.8) lässt es sich leicht verifizieren,
dass bei den in der Einzelphotonenmikroskopie üblichen Intensitäten von
unter 10 6 Wcm −2 und den dazugehörigen Leistungen von unter 1 mW kaum
nennenswerte Zweiphotonenabsorptionen erfolgen; aus (9.8) errechnet sich
k2 ≈ 12,5s −1 für σ2 =20×10 −49 cm 4 s, also gerade mal ein paar pro Sekunde.
Um lebende fluoreszenzmarkierte Zellen schnell genug aufnehmen zu können,
hat man in der Laserrastermikroskopie typische Ortsverweildauern (engl.
pixel dwell time) von 1–10 µs. Selbst bei einer Konzentration von ca. 100 Fluoreszenzmolekülen
pro Ortspunkt wäre das Signal nicht ausreichend. Damit ist
klar, dass Zweiphotonenmikroskopie von vornherein höhere Beleuchtungsintensitäten
erfordert.
Tabelle 9.1. η ist die Quantenausbeute. Zu σ2: relativer Fehler von 30%, alle
Messungen bei der Wellenlänge von 700 nm; zu σ3: relativer Fehler von Faktor 3,
alle Messungen bei 1000 nm. (Daten nach [5])
σ1 × 10 −16
η × σ2 × 10 −50
η × σ3 × 10 −83
[cm 2 ] [cm 4 s] [cm 6 s 2 ]
DAPI (ungebunden) 1,3 (345 nm) 0,16 (700 nm) 0,25 (1000 nm)
Indo-1 (mit Ca 2+ ) 1,3 (340 nm) 1,5 6
Indo-1 (frei) 1,3 (345 nm) 3,5 2
Fura-2 (mit Ca 2+ ) 1,2 (335 nm) 12 30
Fura-2 (frei) 1,0 (362 nm) 11 20
Di-I 4,9 (500 nm) 200 –
Rhodamine B 1,3 (500 nm) 200 –