Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

186 S.W. Hell
Punktabbildungsfunktion gegeben ist
hconf(u, v) =hill(u, v)hdet(u, v) ∼ = h 2 (u, v) . (9.3)
Sie wird als konfokale Punktabbildungsfunktion (C-PSF) bezeichnet
(Abb. 9.2b). Sie ist die effektive Punktabbildungsfunktion des konfokalen
Mikroskops.
Das Quadrieren hat zwei Konsequenzen. Zum einen ist die C-PSF schmaler;
man bekommt eine um den Faktor 1,4 bessere Auflösung, wenn man
die Halbwertsbreite des Hauptmaximums als Maßstab nimmt. Zum zweiten
werden Koordinatenpunkte, die sich weit weg vom Fokus befinden, in ihrem
Beitrag unterdrückt. Deshalb wirkt der Fokus eines konfokalen Mikroskops
wie eine Sonde, welche die Fluoreszenzmoleküle, die sich im Innenbereich
des Fokus befinden, besser registriert als die außen. Sie erfasst einen Intensitätswert,
der proportional zur Zahl der in (u, v) vorhandenen Farbstoffmoleküle
ist und wichtet gemäß dem Faktor hconf(u, v).
Hier muss insbesondere die axiale Diskriminierung hervorgehoben werden.
Rastert man beispielsweise eine unendliche dünne Ebene in axialer Richtung,
so bleibt der in einem großflächigen Detektor gemessene Intensitätswert
gleich, in einem konfokal arrangierten Punktdetektor misst man allerdings nur
dann ein merkliches Signal, wenn die Ebene das Hauptmaximum passiert.
Was geschieht eigentlich mit der Phase des anregenden Lichts? Im Gegensatz
zur Reflektionsmikroskopie geht die Phase des anregenden Lichts bei
der Absorption im Farbstoffmolekül verloren. Die Fluoreszenzmikroskopie ist
damit eine inkohärente Form der Abbildung. Das bedeutet, dass sich das
Bild b(u, v) des fluoreszierenden Objekts aus der dreidimensionalen Faltung
der räumlichen Verteilung der Fluoreszenzmoleküle t(u, v) und der effektiven
PSF h(u, v) ergibt. Die PSF ist also eine ” Apparatefunktion“, die im Fernfeldmikroskop
durch Beugung aber auch durch die optische Anordnung des
Mikroskops bestimmt ist.
Technisch wird die Faltung durch das dreidimensionale Rastern bewerkstelligt.
Will man in die Tiefe einer Probe eindringen, so setzt das natürlich
voraus, dass die Proben transparent sind. Für die meisten Zellen ist das der
Fall, sodass sich die konfokale Rastermikroskopie zum 3D-Mikroskopieverfahren
schlechthin entwickelt hat. Gemäß dem Signalabtasttheorem (Nyquist-
Kriterium) wählt man als Raster eine Punktmatrix, die ca. 2- bis 3-mal feiner
ist als die Auflösungsgrenze. Das bedeutet für hohe Aperturen (wie 1,2–1,4
Ölimmersion) in lateraler Richtung etwa 0,2∆r ≈ 50–100 nm und in axialer
Richtung ca. 80–200 nm.
Es gibt drei Möglichkeiten zu rastern. Im einfachsten Fall befindet sich
die Probe auf einem positionierbarem Verschiebetisch, der eine Feinpositionierung
in drei Dimensionen erlaubt. Eine schnellere und daher viel gängigere
Methode ist die Bewegung des Strahls über die Probe hinweg. Bei den meisten
kommerziell erhältlichen konfokalen Rastermikroskopen wird der Strahl
in lateraler Richtung (x, y) gerastert, während die axiale Positionierung mit