Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 195
Mittlerweile findet man in der Literatur für den Anwender brauchbare
Messungen von Zweiphotonenwirkungsquerschnitten. Für ihn stellt sich auch
die Frage, ob man aus den Einphotonenabsorptionsspektren auf die Zweiphotonenabsorption
schließen kann. Die bisherige Erfahrung ist, dass die meisten
gängigen Farbstoffe, die bei λ einen Einphotonenübergang haben, in der Regel
auch bei 2λ im Zweiphotonenmodus angeregt werden können. Damit wird die
Zweiphotonenmikroskopie für die Fluoreszenzmikroskopie sehr attraktiv. Oft
ist das Zweiphotonenanregungsspektrum leicht blauverschoben, d.h. die optimale
Anregung erfolgt bei Wellenlängen, die etwas (ca. 20–80 nm) kürzer
sind als 2λ.
In den letzten zwei Jahren hat sich herausgestellt, dass neben der Zweiphotonenmikroskopie
auch Dreiphotonenmikroskopie möglich ist. Hier erfolgt die
Anregung durch die simultane Absorption von drei Photonen der Wellenlänge
von 3λ. DerFarbstoffDAPI,derüblicherweise zur Färbung des Zellkerns verwendet
wird, besitzt bei ca. 360 nm ein Einphotonenabsorptionsmaximum.
Er lässt sich im Bereich 640–830 nm im Zweiphotonenmodus anregen und
von 900–1060 nm im Dreiphotonenmodus. Zwischen 830–900 nm liegt ein
Übergangsbereich, bei dem in der Regel eine gemischte Anregung vorliegt; ist
die Intensität hoch, so überwiegt der Dreiphotoneneffekt, ansonsten erfolgt
die Anregung durch zwei Photonen. Der Grund ist, dass die Dreiphotonenanregung
– wie nach dem Vorhergehenden zu erwarten – von der dritten
Potenz der Intensität abhängt. Hohe Intensitäten begünstigen den Dreiphotonenprozess.
In Analogie zu (9.9) und (9.10) gilt für die Zahl der Fluoreszenzphotonen
pro Molekül und Sekunde
k3 = f∆tσ3I 3 peak
(�ω) 3
= ξ2σ3I 3 ave
(�ω) 3 = PaveP 2 peakσ3 (�ω(π∆r) 2 )
3 . (9.11)
Der Dreiphotonenwirkungsquerschnitt hat die Einheit cm 6 s 2 .Für nicht an
DNA gebundenes DAPI wurde bei λ = 1000 nm ein Dreiphotonenwirkungsquerschnitt
von σ3 =0,25 × 10 −83 cm 6 s 2 bestimmt.
Die Proportionalität zu ξ 2 bedeutet, dass die Fluoreszenz bei fester quasikontinuierlicher
Leistung umgekehrt quadratisch mit der Pulsbreite zunimmt;
bei der Zweiphotonenanregung war das nur linear. Hält man die quasikontinuierliche
Leistung konstant und verkürzt dabei die Pulsbreite um die Hälfte,
so verdoppelt sich das Zweiphotonensignal nur, während sich das Dreiphotonensignal
vervierfacht. Im Prinzip suggerieren diese Formeln, dass man
Multiphotonenmikroskopie am besten mit möglichst kurzen Pulsen durchführt.
Als einzige Limitation verbliebe die mit immer kürzeren Pulsen verbundene
immer größere spektrale Bandbreite des Lichts (bei 800 nm und
120 fs Pulsen misst man bereits eine spektrale Bandbreite von ca. 10–12 nm)
und die vorhin diskutierte Sättigung des Moleküls durch einen einzelnen Puls.
In der Tat wird deshalb Zweiphotonenmikroskopie zur Zeit fast ausschließlich
mit gepulsten Titan-Saphir-Lasern betrieben, die Pulse der Größenordnung
von 100–300 fs liefern.