Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

208 S.W. Hell
9.3.2 Multiphotonen-4π-konfokale Mikroskopie
Multiphotonenanregung ist ebenfalls eine geeignete Methode, die Nebenmaxima
zu reduzieren. Regt man den Farbstoff beispielsweise im Zweiphotonenmodus
an, so werden die Nebenmaxima aus zwei Gründen unterdrückt: einerseits
aufgrund quadratischen Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der
Anregungsintensität und andererseits durch die Tatsache, dass bei einer Zweiphotonenanregung
die Anregungswellenlänge etwa doppelt so groß ist wie die
Wellenlänge des Fluoreszenzlichts. Der Erste leuchtet unmittelbar ein, weil
beispielsweise die relative Höhe von 65% der Nebenmaxima in solche von
(0,65) 2 ≈ 42% umgewandelt werden. Der Letzte lässt sich gut aus dem Zustandekommen
der effektiven PSF des zweiphotonen-4π-konfokalen Mikroskops
verstehen:
h 4π,A
�
2phot−conf (u, v) =
h 4π
ill
� u
2
v
��2 , hdet(u, v) . (9.15)
2
Die Verdoppelung der Wellenlänge führt erst einmal zu einer doppelt
ausgedehnten Beleuchtungs-PSF des 4π-konfokalen Mikroskops und damit
auch zum doppelten axialen Abstand der Maxima. Die Detektions-PSF allerdings
bleibt bei derselben Wellenlänge und behält damit ihre räumliche Ausdehnung
bei. Letztendlich bedeutet das, dass die Nebenmaxima der 4π-Beleuchtungs-PSF
mit niedrigeren Bereichen der Detektions-PSF überlappen.
Sie tragen weniger zum Signal im Punktdetektor bei und sind damit in der effektiven
PSF unterdrückt. In der Theorie erreicht man bei typischen Zweiphotonenanregungswellenlängen
von λ = 750 nm, Detektionswellenlängen um
450–500 nm, eine axiale Halbwertsbreite von 140 nm und Seitenmaxima in der
Höhe von 12–15%. Für Dreiphotonenanregungswellenlängen von λ = 1000 nm
sind axiale Halbwertsbreiten von etwa 180 nm und Seitenmaxima von unter
3% vorhergesagt. In der Praxis ist die Unterdrückung nicht so effizient, weil
die Korrektur der Mikroskopobjektive im Infrarotbereich unvollständig ist –
es besteht ein merklicher chromatischer Längsfehler zwischen dem infraroten
Anregungs- und dem sichtbaren Fluoreszenzlicht. Dies führt dazu, dass die
Nebenmaxima eine relative Höhe von ca. 25–30% einnehmen. Die endgültige
Eliminierung der Nebenmaxima erfolgt dann mittels der oben beschriebenen
Entfaltung.
Abbildung 9.12 zeigt die Leistungsfähigkeit eines mit Zweiphotonenanregung
betriebenen 4π-konfokalen Mikroskops, und zwar im direkten Vergleich
mit einem herkömmlichen Zweiphotonenexzitationsmikroskop. Als
Testobjekt dienten Fluoreszenzkügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm,
welche in einem Einbettungsmedium zufällig verteilt waren. Die Aufnahme
des herkömmlichen konfokalen Mikroskops mit einem Objektiv zeigt die Kügelchen
als in axialer Richtung ausgeschmierte helle Flecke. Die axiale Ausschmierung
ist die unmittelbare Folge der Elongation des Fokus entlang der
optischen Achse. Bei der hier verwendeten Apertur von 1,4 (Öl) und einer
Wellenlänge von 760 nm beträgt die axiale Halbwertsbreite des Fokus etwa