Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

8 Konfokale Mikroskopie in der Genomforschung 147
Objekten in Zellkernen, d.h. von Targets, deren Abmessungen nahe oder unterhalb
der lateralen bzw. axialen FWHM der konfokalen PSF liegen. Zur
besseren 3D-Bildanalyse derartiger Targets wurde ein Verfahren entwickelt
[5], das eine Segmentierung unter Berücksichtigung der (experimentellen)
konfokalen PSF für die verwendeten spektralen Signaturen erlaubt. Dazu
wurde die konfokale Abbildung von Modellobjekten rechnerisch simuliert
(virtuelle Mikroskopie). Die volumenkonservierende Schwellwertintensität am
Rand eines Modellobjekts relativ zur Maximalintensität zeigte dabei eine
starke Abhängigkeit vom Targetvolumen, die sich durch eine monoton fallende
Intensitätsvolumenfunktion beschreiben ließ, die von der jeweils relevanten
konfokalen PSF abhängig war. Zu jedem Originalvolumen des Targets
konnte ein relativer Schwellwert (bezogen jeweils auf das Maximum der Intensitätsverteilung)
berechnet werden, durch dessen Anwendung das Originalvolumen
segmentiert werden konnte: Daraus ergab sich eine Kalibrierungsfunktion
Threl(V ), die jedem Targetoriginalvolumen bei gegebener spektraler Signatur
und konfokaler Optik einen volumenkonservierenden relativen Schwellwert
zuordnete. Bei einem Target von zunächst unbekanntem Volumen findet
das Segmentierungsverfahren zunächst Orte lokaler Intensitätsmaxima mit
Hilfe eines oktaederähnlichen Top-Hat-Filters. Ausgehend von diesen Orten
werden die Targets durch einen iterativen 3D-Wachstumsprozess unter Verwendung
der o.g. Funktion Threl segmentiert. Die Anwendung dieses Verfahrens
auf simulierte Verteilungen von kleinen Modelltargets in Zellkernvolumina
unter Verwendung experimenteller konfokaler PSF für ein Mikroskopobjektiv
der Numerischen Apertur 1,32 und die Fluorochrome FITC (Fluoresceinisothiocyanat),
TRITC (Tetramethylrhodaminisothiocyanat) und CY5
(Farbstoff mit Emission im nahen Infrarot) ergab eine brauchbare Segmentation
von Targetvolumen und Targetradius auch erheblich unterhalb des
konfokalen Beobachtungsvolumens bzw. der konfokalen FWHM.
In weiteren Modellsimulationen unter Anwendung dieses Segmentierungsalgorithmus
wurde der Fehler der konfokalen 3D-Distanzmessung zwischen
zufallsverteilten Targets im Zellkernvolumen abgeschätzt, wenn zusätzlich das
Rauschen berücksichtigt wurde, das aus konfokalen experimentellen Messungen
an fluoreszenzmarkierten biologischen Targets gleicher spektraler Signaturen
[106] bestimmt wurde. Bei Targetverteilungen derselben spektralen Signatur
ohne Beschränkung der minimalen Distanz zwischen diesen ergab sich
unter diesen Annahmen eine Standardabweichung der 3D-Distanzfehler ≤
60 nm. Wurde eine minimale Distanz größer als die effektive FWHM gewählt,
so sank die Standardabweichung der simulierten 3D-Distanzfehler auf ca.
30 nm; mit Hilfe eines verbesserten Algorithmus gelang es, auch bei konfokalen
Modellbildern mit zufallsverteilten Targets ohne Abstandsbeschränkung
(Radien 230 nm; Signal-zu-Rausch-Verhältnis wie oben) einen 3D-Distanzfehler
< 30 nm zu erreichen [6].