Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

8 Konfokale Mikroskopie in der Genomforschung 167
” dicke“ transparente Objekte, wie es Zellkerne mit ihren rund 10 µm Durchmesser
sind, mit stark erhöhter räumlicher Auflösung bzw. stark erhöhtem
Auflösungsäquivalent untersuchen könnte. Dann brauchte man die Kerne
nicht physisch in dünne Schichten zu schneiden; man könnte für die gleichzeitige,
spezifische Markierung von Genorten verschiedene spektrale Signaturen
verwenden (z.B. eine Kombination von Fluorochromen mit einem
verschiedenen Fluoreszenzemissionsspektrum, oder mit einer verschiedenen
Fluoreszenzlebensdauer).
Wegen der Wellennatur des Lichts ist zwischen Objekten gleicher spektraler
Signatur eine höhere 3D-Auflösung als einige hundert nm mit ” konventioneller“
Fernfeldepifluoreszenzmikroskopie grundsätzlich nicht erreichbar.
Ernst Abbe selbst wies jedoch bereits darauf hin, dass die von ihm
beschriebenen Grenzen der Auflösung in der Zukunft durch neuartige Techniken
überwunden werden könnten. Normalerweise wird die Erfüllung dieser
Vision auf die Entwicklung der Elektronenmikroskopie und anderer Ultrastrukturmikroskopietechniken
bezogen. Auf der Basis der neuen Gegebenheiten
von Laserlichtquellen, hochpräziser Optoelektronik und leistungsfähiger
digitaler Bildverarbeitung wurde es jedoch möglich, fernfeld-lichtoptische
bildgebende Systeme zu konzipieren [22, 45, 47, 49, 50] und teilweise bereits
in ersten Prototypen zu realisieren [42, 44, 48], die eine erheblich bessere
Auflösung im Fernfeld erreichen als mit konventioneller CLSFM. Langfristig
könnte es möglich werden, im Fernfeld lichtoptisch benachbarte Targets gleicher
spektraler Signatur zu unterscheiden, die einen Abstand von nur ca.
20–30 nm haben. Dies würde etwa 2 Nukleosomendurchmessern entsprechen,
der Basiseinheit der Genomorganisation in Zellkernen.
Haben die im Fernfeld lichtoptisch zu detektierenden Targets nicht die
gleiche, sondern unterschiedliche spektrale Signatur, so sollte ein vergleichbar
gutes oder noch besseres Auflösungsäquivalent auch mit Hilfe der spektralen
Hochpräzisionsmikroskopie realisierbar sein. Dabei würde sich die Möglichkeit
einer molekularen Topologie der untersuchten Chromatinregion ergeben, bei
der sogar 3D-Positionen der Schwerpunkte einzelner benachbarter, spektral
unterschiedlich markierter DNA-Sequenzen von jeweils nur wenigen hundert
Basenpaaren Länge (entsprechend der mit einem einzelnen Nukleosom assoziierten
DNA) quantitativ vermessen werden könnten. Um die dazu erforderliche
3D-Positionierungsgenauigkeit von nur wenigen Nanometern für die die
Position beschreibenden Intensitätsschwerpunkte zu erreichen, müssten hier
pro markierter DNA-Sequenz ca. 10 5 Photonen detektiert werden (H. Bornfleth,
pers. Mitteilung). Bei hohem Markierungsgrad und ausreichend stabilen
Fluorochromen erscheint diese Forderung grundsätzlich realisierbar, z.B. mit
Hilfe von Mehrphotonenanregung. Ein weiteres gravierendes Problem bei
der Realisierung einer molekularen Topologie ausgewählter Genombereiche
besteht darin, den unspezifischen Fluoreszenzhintergrund aus dem durch die
PSF des Systems gegebenen Beobachtungsvolumen genügend zu diskriminieren;
eine ausreichend gute Unterscheidung von Hintergrund und Signal