Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 193
Analog zur Einphotonenanregung lässt sich auch hier die Sättigungsintensität
berechnen, indem man k2 =1/τ setzt. Durch Umformen findet man
Isat 2 = �ω(σ2τ) −1/2 . Nach Einsetzen der Zahlenwerte für Rhodamin B erhält
man als Sättigungsintensität I sat
2 ≈ 5200 MW/cm 2 . Das liegt vier Größenordnungen
über dem für Einphotonenmikroskopie. Rechnet man diesen Wert mit
Hilfe der Apertur in die mittlere Lichtleistung um, so erhält man P ≤ 5W.
Diese Lichtleistung ist so hoch, dass man in einer biologischen Probe
mit unerwünschten Nebeneffekten rechnen müsste. Dazu gehören Erwärmung
durch Einzelphotonenabsorption der Zellsubstanzen, wie z.B. des Wassers in
der Zelle, welches im Infrarotlicht ab 680 nm mit zunehmender Wellenlänge
stärker absorbiert. Bei einer Leistung von P = 5 W, der Wellenlänge λ =
850 nm, einer Ortsverweildauer von 1 ms kann man davon ausgehen, dass
sich das Wasser im Fokus um ca. 3–6 K erhöht. Darüber hinaus gibt es
den Effekt der optischen Pinzette: strahlt man Licht in ein Medium, in
dem sich Mikropartikel befinden, deren Brechungsindex etwas größer ist als
der des Mediums, so werden diese aufgrund von auftretenden dielektrischen
Lichtkräften in den Lichtstrahl hineingezogen und vom Strahl wie von einer
Pinzette mitgeführt. Sicherlich hängt das Mitführen von der Viskosität des
Mediums, von der Geschwindigkeit, mit welcher der Strahl durch die Probe
bewegt wird, von der Größe der Partikel und dem Brechungsindexunterschied
ab. Man kann aber festhalten, dass ab einer Durchschnittsleistung von etwa
30–50 mW der Effekt der optischen Pinzette im Auge zu behalten ist.
Es ist daher naheliegend, Zweiphotonenanregung mit einem gepulsten
Laser zu betreiben. In der Tat ist die zur Zeit am häufigsten verwendete
Lichtquelle der modengekoppelte Titan-Saphir-Laser, der typischerweise Pulse
der Dauer von ∆t = 100–200 fs in dichter zeitlicher Abfolge (von 12,5 ns) emittiert.
Die Pulswiederholrate f beträgt somit 80 MHz. Die hohe zeitliche und
räumliche Konzentration von Photonen die durch die Fokussierung und das
Pulsen zustande kommt, begünstigt die Zweiphotonenabsorption bei einer
gegebenen quasikontinuierlichen Leistung. Letztere gibt die Leistung an, die
man durch zeitliche Mittelung über viele Pulse erhält und ist proportional
zum Gesamtfluss der Photonen. Diese Größe ist für den Praktiker von Bedeutung,
da sie letztendlich auch die Größe ist, die direkt von einem gewöhnlichen
Leistungsmessgerät angezeigt wird.
Nimmt man der Einfachheit halber an, dass es sich bei den emittierten
Pulsen um Rechteckpulse mit der Intensität Ipeak handelt, so ergibt sich die
durchschnittliche Absorptionsrate pro Sekunde und Molekül jetzt zu
k2 = f∆tσ2I2 peak
(�ω) 2 = σ2I 2 ave
f∆t(�ω) 2 ≡ ξσ2I2 ave
(�ω)
2 , (9.9)
wobei wir berücksichtigt haben, dass sich die zeitlich gemittelte Durchschnittsintensität
aus Iave = Ipeakf∆t ≡ Ipeak/ξ berechnet. Vergleicht man (9.9)
mit (9.8), so erkennt man, dass sich bei einer festgelegten quasikontinuierlichen
Intensität die Fluoreszenzrate um den Faktor ξ erhöht. Mit den Leistungsdaten
des Titan-Saphir-Laser erhält man einen beachtlichen Faktor von